馬幫靖，郝翔麟，韓飛，陳洪強(qiáng)，劉晉祎，曹佳， *，張愛(ài)華，*

（1．貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理教研室，貴州貴陽(yáng)550004；2．陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系毒理學(xué)研究所，重慶400038）

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，高居全球男性、發(fā)達(dá)國(guó)家女性癌癥死亡率之首[1]。近年來(lái)，我國(guó)肺癌的發(fā)病率與死亡率已超越其他惡性腫瘤躍升至第1位[2-3]。目前，肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不十分清楚，對(duì)其深入研究有利于改善肺癌的診療及預(yù)后。

SOX30基因?qū)儆赟OX基因家族的H亞族，在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育及功能維持中起重要作用[4-5]。本課題組研究[6]發(fā)現(xiàn)， SOX30是肺癌中的新抑癌基因，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活p53抑制肺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，在肺腺癌中的高表達(dá)有利于患者預(yù)后[7]。最近發(fā)現(xiàn)SOX30能夠抑制肺癌轉(zhuǎn)移，但分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)功能富集分析、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析篩選SOX30調(diào)控的關(guān)鍵基因；通過(guò)差異表達(dá)細(xì)胞模型和基因敲除動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)；采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及劃痕愈合實(shí)驗(yàn)分析相關(guān)基因在SOX30抑癌中的主要作用，為進(jìn)一步研究 SOX30基因的作用及臨床應(yīng)用提供資料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及其培養(yǎng)

A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，本實(shí)驗(yàn)室前期[6]已將SOX30表達(dá)載體轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)SOX30的A549-SOX30穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，這些細(xì)胞株均使用含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的常規(guī)培養(yǎng)箱中，采用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2 SOX30基因敲除小鼠

SOX30基因敲除小鼠品系為C57BL6，委托南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所構(gòu)建，于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))飼養(yǎng)，由本實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)繁殖維護(hù)并利用PCR對(duì)新生小鼠基因型進(jìn)行鑒定。

1.3 主要試劑及儀器

F-12K培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司，總RNA提取試劑Trizol Reagent以及pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-DSC3miRNA干擾質(zhì)粒購(gòu)自Invitrogen公司， Via FectTMTransfection Reagent(E4982)轉(zhuǎn)染試劑盒、GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)及2×Taq PCRMix購(gòu)自Promega公司，殺稻瘟菌素(Blasticidin)購(gòu)自Sigma公司，普通RT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公 司，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)Syngene公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 SOX30蛋白調(diào)控基因功能富集分析基于我們前期獲得的SOX30差異表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)譜數(shù)據(jù)[6]，使用Gene Spring Software11.0(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，US)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用兩樣本t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)基因，顯著差異表達(dá)基因 的 閾值設(shè)定為差異倍數(shù)≥2且 P <0.05，隨后于網(wǎng)站http://www.geneontology.org/在線對(duì)差異基因進(jìn)行基因功能富集分析(GO enrichment analysis)，獲得關(guān)聯(lián)的主要通路及相關(guān)基因的功能。

1.4.2 DSC3啟動(dòng)子區(qū)SOX30蛋白結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jaspar.binf.ku.dk/)在線預(yù)測(cè)DSC3(desmocollin3)啟動(dòng)子區(qū)SOX30蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

1.4.3 臨床標(biāo)本數(shù)據(jù)來(lái)源及熱圖繪制肺癌組織中SOX30與 DSC3基因的表達(dá)數(shù)據(jù)于UCSC Xena(https://xenabrowser.net)下載，二者數(shù)據(jù)集ID均為T(mén)CGA.LUNG.sampleMap/HiSeqV2；通過(guò)提取并進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)匹配獲得具有 SOX30、DSC3基因表達(dá)信息的肺癌及癌旁組織共1129例，其中肺腺癌及癌旁組織576例，肺鱗癌及癌旁組織553例。肺癌組織及癌旁組織中SOX30與DSC3基因的表達(dá)熱圖在網(wǎng)站https: //genome-cancer.ucsc.edu/proj/site/hgHeatmap/在線繪制。

1.4.4 DSC3miRNA干擾細(xì)胞模型的構(gòu)建SOX30差異表達(dá)細(xì)胞模型來(lái)源于前期構(gòu)建[6]的穩(wěn)定表達(dá)pIRES2-EGFP-SOX30質(zhì)粒(A549-SOX30)和對(duì)照質(zhì)粒(A549-Vector)。按每孔3.0×105個(gè)細(xì)胞接種A549-SOX30于6孔板，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)過(guò)夜；參照Via FectTMTransfection Reagent(E4982)轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)配制pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-DSC3miRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物，按每孔200μL分別加至6孔板中，搖勻后于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的常規(guī)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后換用含3μg/mL殺稻瘟菌素的F-12K完全培養(yǎng)液篩選細(xì)胞，直至出現(xiàn)熒光陽(yáng)性克??；挑取熒光陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得A549-SOX30+DSC3miRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系并用于后續(xù)分析。

1.4.5 細(xì)胞與組織的總RNA提取及cDNA合成細(xì)胞株總RNA的抽提參照Trizol(Invitrogen)試劑使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并采用Nano Drop分光光度計(jì)測(cè)定所提總RNA的濃度和純度，然后參照GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)使用說(shuō)明書(shū)合成cDNA。 SOX30基因敲除小鼠肺組織首先進(jìn)行液氮研磨，之后參照上述方法提取總RNA并合成cDNA。

1.4.6 逆轉(zhuǎn)錄PCRSOX30引物，上游序列5′-GATG TCCCGCTCACCGTGTTGC-3′，下游序列5′-GACAGGG CTTGGGCTCTGGACT-3′；DSC3引物，上游序列5′-GACCCTCGTGATCTTCAGTCG-3′，下游序列5′-TCAC TTGACCGGATGAGGTCT-3′；內(nèi)參基因 β -actin引物，上游序列5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACGG-3′，下游序列5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′。逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系(20μL)包括：上、下游引物各1μL，2×Taq PCRMix10μL，cDNA模板1μL，Nuclease-free水7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃、3min；94℃、30s；58℃、30s；72℃、30s；72℃、10min；33個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，各取10μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光分析，拍照并保存圖片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)按每孔200個(gè)細(xì)胞接種A549-Vector、A549-SOX30、A549-SOX30+DSC3miRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞于6孔板，搖勻后于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的常規(guī)培養(yǎng)箱中，用含3μg/mL殺稻瘟菌素的F-12K完全培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，取出細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次，4%多聚甲醛室溫固定30min；結(jié)晶紫染色5min；PBS清洗細(xì)胞2次，空氣中干燥；拍照保存，分析結(jié)果。

1.4.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別將A549-Vector、A549-SOX30、A549-SOX30+DSC3miRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，搖勻后于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞鋪滿皿底(融合度>90%)，用10μL槍頭在6孔板中劃痕，PBS清洗細(xì)胞2次；然后加入無(wú)血清的F-12K培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于劃痕后0、48h在同一位置利用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照；統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞遷移情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用x±s 表 示，兩樣本均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)，肺癌中SOX30與DSC3基因表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SOX30轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)功能富集分析

為了尋找 SOX30基因抑制腫瘤的可能下游通路，我們首先對(duì) SOX30基因差異表達(dá)細(xì)胞系基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了功能富集分析(GO分析)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX30廣泛與黏著斑(focal a dhesion)、錨定連接(anchoring junction)、黏著連接(adherens junction)、細(xì)胞連接(cell juncion)、細(xì)胞骨架(cytoskeleton)等在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵調(diào)控作用的細(xì)胞連接相關(guān)基因表達(dá)顯著相關(guān)，提示SOX30抑癌功能發(fā)揮可能與細(xì)胞黏附相關(guān)通路有關(guān)(見(jiàn)圖1)。

圖1 基于SOX30轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)譜經(jīng)功能富集分析潛在的下游通路

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) SOX30基因可能調(diào)控DSC3基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步明確哪些細(xì)胞間連接相關(guān)基因可能受SOX30蛋白的調(diào)控，我們利用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jaspar.binf.ku.dk)對(duì)SOX30蛋白潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因進(jìn)行了在線預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 DSC3基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)SOX30蛋白結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)表1)，提示SOX30很可能調(diào)控DSC3的表達(dá)。

表1 DSC3啟動(dòng)子區(qū) SOX30蛋白結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 SOX30與 DSC3基因在肺腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

DSC3是一種鈣依賴性糖蛋白，與腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成、侵襲和遷移等調(diào)控有關(guān)。由此我們推測(cè)SOX30基因的抑癌作用可能與DSC3有關(guān)。為了進(jìn)一步明確SOX30與DSC3在肺癌中的潛在調(diào)控關(guān)系，我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了 SOX30基因與 DSC3基因在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá) 的 相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)(見(jiàn)圖2A)。由于前期研究[7]表明SOX30主要在肺腺癌中發(fā)揮作用，為此我們進(jìn)一步分析了二者在肺腺癌和肺鱗癌中的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示二者在肺腺癌中表達(dá)正相關(guān)(見(jiàn)圖2B)，在肺鱗癌中表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)(見(jiàn)圖2C)，提示二者在臨床肺腺癌中存在調(diào)控關(guān)系。

圖2 SOX30 與 DSC3基因在 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析

2.4 SOX30蛋白是 DSC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵分子

為進(jìn)一步確證 SOX30 與 DSC3基因之間的調(diào)控關(guān)系，我們分析了SOX30差異表達(dá)細(xì)胞系中DSC3的表達(dá)， SOX30基因高表達(dá)的A549-SOX30細(xì)胞中DSC3 mRNA表達(dá)也顯著上調(diào)(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明 SOX30基因能夠調(diào)控 DSC3基因的表達(dá)，但是這種調(diào)控是不是必須的呢？為此，我們利用 SOX30基因敲除動(dòng)物模型，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)了野生型(SOX30+/+) 、雜合子(SOX30+/-)以及純合子(SOX30-/-)小鼠肺組織中DSC3mRNA 的 表達(dá)情況，結(jié)果顯示純合子(SOX30-/-)小鼠肺組織中DSC3 mRNA表達(dá)水平顯著低于雜合子(SOX30+/-)及野生型(SOX30+/+)小鼠(見(jiàn)圖4)，表明SOX30蛋白是調(diào)控 DSC3基因表達(dá)的關(guān)鍵分子。

圖3 各細(xì)胞中SOX30與 DSC3mRNA 的表達(dá)

2.5 SOX30蛋白對(duì)A549細(xì)胞的集落形成抑制依賴于DSC3基因的表達(dá)

圖4 SOX30基因敲除小鼠肺組織中SOX30與DSC3m RNA 的表達(dá)

為確定 DSC3基因是否參與SOX30蛋白抑制肺癌細(xì)胞增殖的過(guò)程，我們進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SOX30的A549-SOX30細(xì)胞集落形成數(shù)較對(duì)照A549-Vector細(xì)胞顯著降低，表明SOX30高表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞集落形成，而在A549-SOX30+DSC3miRNA細(xì)胞中， DSC3基因的表達(dá)被干擾后細(xì)胞集落形成數(shù)較A549-SOX30細(xì)胞顯著增加(見(jiàn)圖5)。這提示 SOX30基因抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用依賴于 DSC3基因的表達(dá)。

圖5 干擾DSC3基因表達(dá)減弱SOX30基因?qū)?A 549細(xì)胞集落形成的抑制

2.6 SOX30基因?qū)549細(xì)胞的遷移抑制依賴于DSC3基因的表達(dá)

由于DSC3是橋粒關(guān)鍵構(gòu)成蛋白，為探索 DSC3基因是否參與了 SOX30基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的抑制，我們利用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)分析表明，過(guò)表達(dá)SOX30的A549-SOX30細(xì)胞相對(duì)遷移率較對(duì)照A549-Vector細(xì)胞顯著降低，表明SOX30高表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞遷移；而在A549-SOX30+DSC3miRNA細(xì)胞中，即 DSC3基因的表達(dá)被干擾后顯著減弱 SOX30基因?qū)549細(xì)胞遷移的抑制作用，細(xì)胞遷移率較A549-SOX30細(xì)胞顯著升高(見(jiàn)圖6)。這提示SOX30基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移與DSC3高度相關(guān)。

圖6 干擾DSC3基因表達(dá)減弱 SOX30基因?qū)?A 549細(xì)胞遷移的抑制

3 討論

脊椎動(dòng)物細(xì)胞間連接主要有黏著連接(adherens junction，AJ)和橋粒(半橋粒)兩種類型。橋粒(desmosome)在細(xì)胞間信息交流、細(xì)胞定位、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織機(jī)械張力等調(diào)控中起著重要作用[8-9]。腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)必要步驟就是原發(fā)腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞間連接，包括黏著連接和橋粒結(jié)構(gòu)的分解和調(diào)控[10]。多項(xiàng)研究表明，橋粒相關(guān)蛋白參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)橋?；虻霓D(zhuǎn)錄激活是橋粒基因表達(dá)調(diào)控的一種重要途徑[12-16]。SOX30是典型的轉(zhuǎn)錄因子，作為一個(gè)新的抑癌基因，在肺癌的發(fā)生中起著重要作用，但是相關(guān)的機(jī)制還不清楚。本研究對(duì)SOX30差異表達(dá)基因進(jìn)行了功能富集分析，發(fā)現(xiàn)SOX30基因的功能主要與黏著斑、錨定連接、黏著連接等細(xì)胞連接信號(hào)通路顯著相關(guān)，同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)橋粒關(guān)鍵基因 DSC3可能受SOX30蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 DSC3基因定位于人類染色體18q12.1，編碼產(chǎn)物含896個(gè)氨基酸多肽。DSC3蛋白是一種鈣依賴性糖蛋白，且是鈣黏蛋白超家族的橋粒子家族的成員，可與其他家族成員相互作用而促成細(xì)胞橋粒介導(dǎo)的細(xì)胞黏附[17]。多項(xiàng)研究表明，DSC3在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，包括結(jié)直腸癌[18-20]、前列腺癌[21]和乳腺癌[22]。Cui等[14]研究發(fā)現(xiàn)DSC3是肺癌中一個(gè)新的抑癌基因，它可以抑制肺癌的增殖、侵襲和遷移。我們推測(cè)SOX30基因可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控DSC3而發(fā)揮抑癌功能。為此，我們進(jìn)一步利用差異表達(dá)細(xì)胞模型和基因敲除動(dòng)物模型驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SOX30后顯著上調(diào)A549細(xì)胞中DSC3mRNA 的 表達(dá)，敲除 SOX30基因后，小鼠肺組織中DSC3mRNA 的 表達(dá)顯著下調(diào)，表明SOX30對(duì)DSC3 的表達(dá)有著關(guān)鍵的調(diào)控作用，提示SOX30可能是一個(gè)新的橋?；蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

由于DSC3受SOX30表達(dá)調(diào)控，因此有可能在SOX30抑癌中發(fā)揮重要作用。我們前期的研究[7]也表明，SOX30在肺腺癌中是一個(gè)典型的抑癌基因，其表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后正相關(guān)，而在肺鱗癌中無(wú)明顯的抑癌作用，因此，SOX30與DSC3的表達(dá)僅在肺腺癌中相關(guān)，與 SOX30基因的功能一致。為明確DSC3是否是SOX30基因在肺腺癌中發(fā)揮抑癌功能的可能下游分子，我們利用集落形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾 DSC3基因的表達(dá)后是否會(huì)影響SOX30對(duì)A549細(xì)胞的增殖和遷移抑制，結(jié)果顯示干擾 DSC3基因的表達(dá)顯著減弱SOX30對(duì)A549細(xì)胞的增殖和遷移抑制，表明DSC3是SOX30在肺腺癌中發(fā)揮抑癌功能的重要分子。但是，二者之間的這種調(diào)控作用，如何在腫瘤發(fā)生過(guò)程中影響橋粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)？是否二者進(jìn)一步調(diào)控其他下游信號(hào)通路，都值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)SOX30是橋?；駾SC3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，且DSC3是SOX30發(fā)揮抑癌功能的重要下游靶分子。本研究為進(jìn)一步探索 SOX30基因功能以及SOX30-DSC3在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用和臨床意義提供了重要依據(jù)。

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