杜恩輔，徐 霖，周選民，劉梅訊，張曉龍，崔 寧，侯平志，余惠芬

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心 442000)

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見(jiàn)的肝癌亞型，發(fā)病率占全球第5位[1]，HCC確診后的5年生存率不足12%[2]。分子靶向藥物為肝癌治療提供了新的策略[3-4]，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)3是肝素硫酸多糖家族的一個(gè)膜蛋白[5]。自1997年有學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)GPC3的mRNA在HCC組織中高度表達(dá)后，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)GPC3的生物學(xué)特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GPC3在超過(guò)70%的HCC中表達(dá)，在正常肝組織中不表達(dá)[6-7]。因此，GPC3是一種腫瘤特異性抗原，在腫瘤分子免疫靶向治療方面有重要應(yīng)用前景?；贕PC3的高表達(dá)，羅氏公司研發(fā)出Codrituzumab成為GPC3陽(yáng)性肝癌的潛在治療手段[8]。本研究以GPC3為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了單鏈抗體，并將單鏈抗體與熒光染料結(jié)合，使其在體內(nèi)外對(duì)GPC3陽(yáng)性腫瘤都有很好的靶向性，并使其生物相容性增加，半衰期延長(zhǎng)，為實(shí)驗(yàn)室研究或臨床檢測(cè)提供了新的手段與技術(shù) ，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Life公司；蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)羊抗人IgG-Fc單克隆抗體購(gòu)自南賽博生物公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；羅丹明B熒光染料購(gòu)自上海碧云天公司； Balb/c裸鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物所；(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)自南京晚晴公司；活性近紅外熒光基團(tuán)(NIRB-NHS)試劑盒購(gòu)自上?？七h(yuǎn)迪生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及相關(guān)培養(yǎng)耗材購(gòu)自美國(guó)熱電公司。

1.2方法

1.2.1融合蛋白表達(dá)及純化 通過(guò)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索Codrituzumab輕鏈與重鏈可變區(qū)蛋白序列，使用G4S柔性肽將二者連接在一起，并通過(guò)畢赤酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化后送公司合成，導(dǎo)入工程質(zhì)粒中。采用畢赤酵母X-33表達(dá)系統(tǒng)，發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀法初步提取后采用鎳柱進(jìn)一步分離純化得到電泳純蛋白，最后利用Western Blot對(duì)純化得到的蛋白進(jìn)行鑒定，以期獲得高產(chǎn)量、高純度的融合蛋白。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù) 制備Huh-7單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)在106個(gè)/組。分為單鏈抗體組和脫脂牛奶空白對(duì)照組。每組分別加入250 μL相應(yīng)的抗體或脫脂牛奶，抗體濃度為200 μg/mL，冰上孵育1 h，洗滌，孵育鼠抗His抗體，洗滌，再孵育FITC-偶聯(lián)的羊抗人IgG抗體，洗滌，上機(jī)檢測(cè)。使用FlowJo 7.6.1對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.2.3激光共聚焦體外成像試驗(yàn) 取羅丹明B 4.79 mg溶于1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH為7.2)中，加入EDC、NHS，摩爾比羅丹明B∶EDC∶NHS=1.0∶1.1∶1.2，避光反應(yīng)4 h，活化。反應(yīng)后溶液再加入一定量的單鏈抗體(scFv)，摩爾比羅丹明B∶scFv=1.0∶1.2，繼續(xù)避光攪拌反應(yīng)，6 h后停止反應(yīng)得到產(chǎn)物粗品。使用超濾管純化，5 000 r/min離心10 min。將1 mL羅丹明B-scFv加入到已培養(yǎng)24 h的Huh-7細(xì)胞中，37 ℃孵育2 h，以PBS洗2遍即可使用激光共聚焦觀察內(nèi)吞情況。

1.2.4近紅外體內(nèi)成像試驗(yàn) 本研究分為兩組，試驗(yàn)組為Anti-GPC3 scFv組，另設(shè)置一個(gè)探針?lè)忾]組(Blocking組)。首先制備NIRB-Anti-GPC3 scFv熒光探針，將1 mg NIRB-NHS粉末溶于100 μL的DMSO中，濃度為0.01 mg/μL；將配制好的染料立即逐滴加入保存于含有Anti-GPC3 scFv(水平為10 mg/mL)的PBS中，放至搖床室溫反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液加入超濾管中進(jìn)行超濾，4 000 r/min 離心30 min，重復(fù)3次，取超濾管上層溶液，凍干可得到標(biāo)記近紅外線熒光探針(IRB)的相應(yīng)固體粉末。Blocking組是將熒光探針NIRB-Anti-GPC3 scFv與Anti-GPC3 scFv按物質(zhì)的量1∶50混合制備Blocking組探針，終濃度為50 μmol/L。建立Huh-7荷瘤小鼠動(dòng)物模型，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh-7細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min后用生理鹽水重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于裸鼠左側(cè)腋皮下。待腫瘤體積接近80 mm3，經(jīng)尾靜脈注射試驗(yàn)組探針及 Blocking 組探針100 μL。注射0、4、8、12 h后，分別對(duì)兩組小鼠進(jìn)行近紅外成像拍照。使用CCD照相機(jī)實(shí)時(shí)收集熒光信號(hào)，對(duì)結(jié)果拍照并分析。

2 結(jié) 果

2.1單鏈抗體Anti-GPC3 scFv的WB驗(yàn)證及親和力驗(yàn)證 見(jiàn)圖1。Codrituzumab輕鏈與重鏈可變區(qū)蛋白序列通過(guò)PCR將二者采用G4S柔性肽連接在一起并導(dǎo)入工程質(zhì)粒中，畢赤酵母X-33進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀法和鎳柱純化得到單鏈抗體Anti-GPC3 scFv，并進(jìn)行WB驗(yàn)證，Anti-GPC3 scFv的相對(duì)分子質(zhì)量為28×103。獲得了純度較高且裝配正確的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv。

注：A為WB驗(yàn)證單鏈抗體Anti-GPC3 scFv相對(duì)分子質(zhì)量；M為蛋白marker；1為純化的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv； B為單鏈抗體Anti-GPC3 scFv與Huh-7細(xì)胞的結(jié)合驗(yàn)證

圖1單鏈抗體Anti-GPC3 scFv的WB驗(yàn)證及親和力驗(yàn)證

2.2Anti-GPC3 scFv與Huh-7細(xì)胞結(jié)合率 抗GPC3的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv能有效結(jié)合到HCC Huh-7細(xì)胞表面。Anti-GPC3 scFv與Huh-7細(xì)胞的結(jié)合率為40.3%，表明制備的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv仍然保留有母體抗體的結(jié)合活性。

2.3激光共聚焦試驗(yàn)驗(yàn)證Anti-GPC3 scFv的體外靶向性 見(jiàn)圖2。通過(guò)激光共聚焦成像試驗(yàn)驗(yàn)證單鏈抗體Anti-GPC3 scFv的體外靶向性，其可在體外很好地靶向HCC Huh-7細(xì)胞。在單鏈抗體與熒光染料羅丹明B偶聯(lián)后，經(jīng)過(guò)與Huh-7細(xì)胞2 h孵育，通過(guò)激光共聚焦成像觀察并拍攝了細(xì)胞水平的成像照片，并通過(guò)Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，單鏈抗體組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度為218.61±9.03，明顯優(yōu)于阻斷對(duì)照組的31.74±5.28。通過(guò)激光共聚焦試驗(yàn)可以確定設(shè)計(jì)的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv與羅丹明B偶聯(lián)后可很好地進(jìn)行HCC Huh-7細(xì)胞的體外檢測(cè)，為進(jìn)一步體內(nèi)靶向性試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

圖2 激光共聚焦試驗(yàn)驗(yàn)證Anti-GPC3 scFv的體外靶向性

2.4近紅外成像試驗(yàn)驗(yàn)證Anti-GPC3 scFv的體內(nèi)靶向性 見(jiàn)圖3。本試驗(yàn)使用NIRB-NHS試劑盒將熒光基團(tuán)與抗單鏈抗體Anti-GPC3 scFv偶聯(lián)，制成NIRB-Anti-GPC3 scFv熒光探針，通過(guò)近紅外成像系統(tǒng)對(duì)NIRB-NHS定位，觀察抗體的體內(nèi)靶向性。從試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射NIRB-Anti-GPC3 scFv后，單鏈抗體首先由尾靜脈進(jìn)入心臟；4 h時(shí)單鏈抗體在全身彌散并開(kāi)始經(jīng)膀胱代謝，腫瘤組織有Anti-GPC3 scFv富集，其他組織無(wú)富集；6～12 h時(shí)體內(nèi)Anti-GPC3 scFv經(jīng)膀胱代謝逐漸減少，在8 h時(shí)腫瘤組織仍有微弱富集。從Blocking試驗(yàn)可以看出，NIRB-Anti-GPC3 scFv的靶向效果可被Anti-GPC3 scFv競(jìng)爭(zhēng)性抑制。試驗(yàn)組與 Bolcking組在注射后8 h時(shí)腫瘤組織的熒光信號(hào)與正常組織熒光信號(hào)比值分別為8.27±2.94和1.09±0.63，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。體內(nèi)近紅外試驗(yàn)驗(yàn)證了Anti-GPC3 scFv的體內(nèi)靶向性，其可以在體內(nèi)準(zhǔn)確地靶向HCC，有開(kāi)發(fā)為檢測(cè)試劑的潛能。

圖3 近紅外成像試驗(yàn)驗(yàn)證Anti-GPC3 scFv的體內(nèi)靶向性

3 討 論

近年來(lái)，醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)交叉應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)——科學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)成為臨床檢測(cè)的研究重點(diǎn)。隨著熒光成像技術(shù)的逐漸發(fā)展，其在細(xì)胞成像、心血管成像、近紅外熒光分析、微量生物活性物質(zhì)檢測(cè)等生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[9]，尤其在腫瘤成像領(lǐng)域有很好的前景。但是大多數(shù)熒光試劑的相對(duì)分子質(zhì)量較小，靶向性差，并且在體內(nèi)半衰期短，很難達(dá)到檢測(cè)要求。GPC3是HCC研究的熱門(mén)靶點(diǎn)，其在HCC腫瘤細(xì)胞表面呈高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，其主要在原發(fā)性HCC及癌旁組織中表達(dá),沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其在良性肝病肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞癌及正常肝組織中表達(dá)[10]。由于GPC3在HCC中呈高表達(dá)，其有很大的潛力開(kāi)發(fā)成為一種試驗(yàn)和臨床檢測(cè)的靶點(diǎn)[11]。與原核細(xì)胞展示型抗體庫(kù)相比,采用哺乳動(dòng)物抗體庫(kù)篩選獲得的修飾后單鏈抗體相對(duì)于原核細(xì)胞抗體庫(kù)有更好的低免疫原性和特異性。此外，全長(zhǎng)抗體比單鏈抗體的穩(wěn)定性及半衰期更高、更長(zhǎng),其Fc段可以和靶細(xì)胞Fc段結(jié)合,從而激活補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[12-13]。因此,全長(zhǎng)全人源的抗GPC3抗體在原發(fā)性HCC的診斷和治療上有巨大潛力。

由于單鏈抗體相對(duì)于全長(zhǎng)抗體的優(yōu)勢(shì)在于其相對(duì)分子質(zhì)量較小，生產(chǎn)成本較低，并且擁有更好的體內(nèi)外滲透性，故在檢測(cè)領(lǐng)域擁有較好的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)單鏈抗體與熒光染料的偶聯(lián)，不僅可以發(fā)揮單鏈抗體較強(qiáng)的靶向能力，還可應(yīng)用熒光探針檢測(cè)的方便與準(zhǔn)確，同時(shí)克服熒光染料在體內(nèi)靶向性差和半衰期短等問(wèn)題，是一種很好的檢測(cè)手段，具有研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力[14]。因?yàn)镚PC3特異地表達(dá)在HCC細(xì)胞表面，而臨床研究顯示，使用單克隆抗體靶向GPC3可引發(fā)抗體依賴的細(xì)胞毒反應(yīng)。Codrituzumab作為羅氏公司開(kāi)發(fā)的全長(zhǎng)全人源抗GPC3抗體，可有效治療GPC3陽(yáng)性HCC。有研究發(fā)現(xiàn)，在藥物暴露劑量、外周血免疫細(xì)胞表達(dá)CD16及GPC3高表達(dá)的腫瘤患者中，Codrituzumab可以延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存期或總生存期，且Codrituzumab沒(méi)有顯示出特殊的毒副作用[15]。

本研究成功構(gòu)建并表達(dá)單鏈抗體Anti-GPC3 scFv，并進(jìn)行了Anti-GPC3 scFv體內(nèi)外靶向性驗(yàn)證，流式細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，單鏈抗體Anti-GPC3 scFv對(duì)HCC Huh-7細(xì)胞保持很好的體外結(jié)合能力。同時(shí)體外激光共聚焦試驗(yàn)驗(yàn)證了單鏈抗體Anti-GPC3 scFv與羅丹明B偶聯(lián)后可很好地對(duì)HCC Huh-7細(xì)胞進(jìn)行靶向，并且熒光效果明顯，可以作為體外HCC細(xì)胞檢測(cè)的重要手段。通過(guò)進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)，本研究將單鏈抗體Anti-GPC3 scFv與NIRB-NHS進(jìn)行偶聯(lián)，獲得了在體內(nèi)也擁有熒光活性的單鏈抗體。試驗(yàn)結(jié)果表明，單鏈抗體Anti-GPC3 scFv可以很好地在體內(nèi)靶向HCC細(xì)胞，并且通過(guò)成像手段檢測(cè)到清晰的熒光信號(hào)。

綜上所述，相對(duì)于單純的單鏈抗體或熒光染料，本研究設(shè)計(jì)的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv偶聯(lián)熒光染料的探針可以很好地對(duì)HCC細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)外靶向。這種偶聯(lián)手段簡(jiǎn)單易行，而且熒光信號(hào)較強(qiáng)，可以作為試驗(yàn)檢測(cè)或臨床檢測(cè)的手段，有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的潛力。

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