林曉佳，吳 姍，陳吳健，任 琰，沈旭芳

（浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016）

當(dāng)外來(lái)物種在非原產(chǎn)地新生態(tài)環(huán)境中建立種群，進(jìn)一步傳播擴(kuò)散改變或威脅本地生物多樣性且?guī)?lái)一定危害與影響的時(shí)候，就成為外來(lái)入侵物種（Alien invasive species）[1]。中國(guó)國(guó)土廣袤，幅員遼闊，自然地理?xiàng)l件復(fù)雜，無(wú)論棲息地類(lèi)型還是結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)多樣化的特征，幾乎適宜任何外來(lái)物種歸化[2]。植物入侵一般比動(dòng)物入侵更頻繁，更常見(jiàn)，入侵物種數(shù)量更大，危害程度更高[3]。植物入侵意味著外來(lái)植物可能取代土著植物，導(dǎo)致土著植物多樣性降低，最終導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)多樣性的改變[4]。據(jù)調(diào)查研究顯示，中國(guó)外來(lái)入侵植物約 500種，主要為菊科Compositae，豆科Leguminosae，禾本科Gramineae，莧科Amaranthaceae等，優(yōu)勢(shì)屬中較為突出的是莧科莧屬Amaranthus[1]。該屬的刺莧A. spinosus，反枝莧A. retroflexus，長(zhǎng)芒莧A. palmeri屬于雜草，種子細(xì)小，結(jié)實(shí)量極大，且具有化感潛力[5]。刺莧原產(chǎn)熱帶美洲，目前中國(guó)、日本、印度、中南半島、馬來(lái)西亞、菲律賓等地皆有分布。我國(guó)19世紀(jì)30年代在澳門(mén)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已成為我國(guó)熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區(qū)的常見(jiàn)雜草，廣布于陜西、河北、北京、山東、安徽、浙江、廣東、香港、臺(tái)灣等二十余個(gè)省市。刺莧胞果邊熟邊開(kāi)裂，散落種子于土壤中，入侵曠地、園圃、農(nóng)耕地等，常大量孳生危害旱作農(nóng)田、蔬菜地及果園，嚴(yán)重消耗土壤肥力[6]，對(duì)生長(zhǎng)在其周?chē)参锏拿劝l(fā)和光合速率都會(huì)有一定的影響，降低多種作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[5]。成熟植株有刺因而清除比較困難，并傷害人畜。2010年被我國(guó)環(huán)保部列入“中國(guó)第二批外來(lái)入侵物種名單”，成為我國(guó)第二批十種外來(lái)入侵雜草之一[6]。

入侵生物的傳播途徑主要有3種。有意識(shí)引進(jìn)，即人為引進(jìn)具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值、實(shí)用價(jià)值的物種，最后演變?yōu)槿肭址N；無(wú)意識(shí)引進(jìn)，即隨著貿(mào)易、運(yùn)輸、旅游等活動(dòng)而傳入的物種演變而成的入侵種；自然入侵，即通過(guò)物種自身的擴(kuò)散能力或者借助自然條件而實(shí)現(xiàn)的入侵[7]。據(jù)悉，中國(guó)外來(lái)入侵植物中約 50%是由于檢疫人員疏漏，隨貿(mào)易品、運(yùn)輸工具等方式引進(jìn)，即無(wú)意識(shí)引進(jìn)。但隨著貿(mào)易全球化，人為活動(dòng)范圍的擴(kuò)大，進(jìn)出口貿(mào)易量的與日俱增，對(duì)檢疫工作提出了更高的要求。而檢疫工作中面臨的業(yè)務(wù)量大、鑒定專家匱乏，特別是植物物種鑒定通常以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定為主，若植物以種子、果實(shí)等形態(tài)出現(xiàn)，或形態(tài)學(xué)信息不足等都會(huì)使鑒定面臨困難[8]。利用分子生物學(xué)手段，通過(guò)檢測(cè)物種DNA序列中特異性的片段，是解決形態(tài)學(xué)鑒定不足的有效方法之一，也為快速檢疫鑒定攜帶或夾帶的植物樣本或種子提供有效的解決方案。實(shí)時(shí)熒光 PCR方法是基于傳統(tǒng)PCR法的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)具有物種特異性的引物和探針，通過(guò)特異性引物的擴(kuò)增，鑒定該物種是否為目標(biāo)物種，同時(shí)結(jié)合具有熒光標(biāo)識(shí)的探針實(shí)現(xiàn)同步擴(kuò)增同步檢測(cè)，提高檢測(cè)效率。本研究基于植物葉綠體基因的保守片段，研究了刺莧和莧屬植物的實(shí)時(shí)熒光PCR快速鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 供試樣品

供試植物樣品包括莧科莧屬7種（包含刺莧的9個(gè)不同地理種、長(zhǎng)芒莧的2個(gè)不同地理種和其它5種）和莧科非莧屬8種，以及莧科外植物3種共27個(gè)樣品（表1）。2014－2015年7－8月，在浙江、江蘇及廣東等地糧庫(kù)周邊、農(nóng)舍周?chē)?、村道邊和田間等地采集相關(guān)植物樣品，每個(gè)采集地點(diǎn)每種樣品均隨機(jī)采集3株，將其放入塑料樣品保鮮袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后放置于－70℃冰箱保存、備用。種子樣品是2015年從進(jìn)口大豆中截獲，置于4℃冰箱中保存、備用。

表1 供試樣品Table 1 Samples for test

1.2 基因組DNA提取

每株植物樣品取2 g葉片，用液氮研磨后混勻，再取其中0.2 g；每個(gè)種子樣品隨機(jī)抽取10粒，用液氮研磨后混勻，再分別采用QIAGE N DNeasy Plant Mini Kit（美國(guó)）試劑盒提取，得到的DNA溶解在50 μL去離子水中。所得DNA樣品置于－20℃冰箱保存、備用。

1.3 特異性引物探針的設(shè)計(jì)與合成

引物和探針的設(shè)計(jì)是基于葉綠體的PsbA基因（Genbank登錄號(hào)：DQ006133.1），通過(guò)Primer 5軟件選取了ASP-1和ASP-2兩組具有刺莧特異性的引物探針（表2）。本研究所用的TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

表2 引物探針序列Table 2 Primers and probes designed for detection of A. spp.

1.4 TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系如下：10 μL Premix Ex Taq（Takara，中國(guó)），上游引物（10 pmol·μL-1）0.4 μL，下游引物（10 pmol·μL-1）0.4 μL，探針（10 pmol·μL-1）0.4 μL，取上述提取得到DNA液2 μL，用去離子水補(bǔ)足體積至20 μL。陰性對(duì)照反應(yīng)用2 μL的去離子水替代DNA進(jìn)行反應(yīng)。應(yīng)用熒光定量PCR儀lightcycle 480（Roche，美國(guó)）進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?）95℃，10 s；（2）95℃，5 s；58～62℃（每2℃為一個(gè)梯度進(jìn)行優(yōu)化），23 s；40個(gè)循環(huán)。在特異性和靈敏度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，real-time PCR反應(yīng)都重復(fù)3次，Ct值表示結(jié)果（Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），SD表示標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 引物的特異性和靈敏度驗(yàn)證

1.5.1 特異性驗(yàn)證 對(duì)27個(gè)樣品進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物探針的特異性（表3）。同時(shí)設(shè)置了3個(gè)PCR退火溫度（58℃，60℃，62℃），以比較不同溫度下的熒光PCR反應(yīng)特異性。

1.5.2 靈敏度驗(yàn)證 以初始濃度為6.7 ng·μL-1的衢州刺莧DNA為材料，用去離子水對(duì)上述DNA進(jìn)行2倍稀釋，共得到12個(gè)濃度的DNA樣本進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證引物探針ASP-1與ASP-2的靈敏度（表4）。其中DNA的初始濃度通過(guò)核酸濃度儀（Nanodrop 1000）測(cè)定獲得，其余樣品的濃度則通過(guò)2倍梯度稀釋推算得到[9]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

熒光PCR反應(yīng)完成后，用儀器自帶的軟件lightcycle 480 software release計(jì)算并得到Ct值。根據(jù)重復(fù)3次的Ct值，利用Excel 2007軟件計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。取3次結(jié)果的平均值，平均Ct值＞35.0或無(wú)Ct值可判為陰性，Ct值≤35.0可判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針特異性驗(yàn)證

設(shè)計(jì)的兩組引物探針經(jīng)特異性驗(yàn)證后顯示，不同的擴(kuò)增溫度對(duì)引物探針的特異性存在影響。58℃時(shí)，ASP-1不僅能在刺莧中擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，同時(shí)也能在莧屬植物中擴(kuò)增到目的片段，但當(dāng)溫度提高到60℃時(shí)，特異性有所升高，當(dāng)溫度設(shè)定為62℃時(shí)，只有目標(biāo)物種得到陽(yáng)性結(jié)果（表3）。對(duì)莧屬具有特異性的引物探針組合ASP-2而言，當(dāng)擴(kuò)增溫度設(shè)定為58℃時(shí)，在非莧屬植物中也出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增，但當(dāng)溫度設(shè)為 60℃和 62℃時(shí)，分別都只有在目標(biāo)莧屬植物中得到了陽(yáng)性結(jié)果，但在60℃時(shí)，得到的Ct值低于62℃時(shí)的結(jié)果，相比較60℃時(shí)檢測(cè)的靈敏度較高。因此，ASP-1適合作為刺莧的實(shí)時(shí)熒光 PCR特異性鑒定引物探針，其最佳擴(kuò)增溫度 62℃；ASP-2適合作為莧屬的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性鑒定引物探針，其最佳擴(kuò)增溫度為60℃。

表3 引物探針特異性驗(yàn)證Table 3 Specificity verification for the primers and probes

2.2 引物探針靈敏度驗(yàn)證

驗(yàn)證結(jié)果顯示（表4），當(dāng)DNA濃度稀釋至0.03 ng·μL－1時(shí)，ASP-1得到的Ct值為32.2，當(dāng)濃度降至0.02 ng·μL－1時(shí)，Ct值已經(jīng)低于檢測(cè)限。該引物探針的靈敏度為0.03 ng·μL－1。而ASP-2的靈敏度則相對(duì)高，當(dāng)檢測(cè)用DNA的濃度降低至0.01 ng·μL－1時(shí)，得到的Ct值為33.8，DNA濃度進(jìn)一步降低至0.005 ng·μL－1時(shí)才出現(xiàn)陰性結(jié)果。

表4 引物探針靈敏度驗(yàn)證Table 4 Sensitivity verification for the primers and probes

3 結(jié)論與討論

目前國(guó)內(nèi)對(duì)刺莧和莧屬的研究主要集中在其形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、生理生化和適生性分析，如姜建萍等研究了刺莧的顯微結(jié)構(gòu)[10]；李潔運(yùn)用多種色譜學(xué)方法深入而系統(tǒng)地研究了刺莧的化學(xué)成分，并依據(jù)其化學(xué)成分進(jìn)行生物活性研究，從而評(píng)價(jià)刺莧的生物活性與化學(xué)成分之間的關(guān)系[11]；陶愛(ài)林等利用基因克隆技術(shù)，同時(shí)采用生物信息學(xué)軟件MULTIPREDSWISS-MODEL在線軟件對(duì)所得基因編碼蛋白進(jìn)行抗原性評(píng)估及三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬[12]；黃飛龍等采用原核系統(tǒng)高效表達(dá)刺莧花粉過(guò)敏原 Prf23的條件及免疫學(xué)鑒定[13]；李妮亞等和崔聰淑等分別對(duì)刺莧種子的萌發(fā)特性和野生刺莧種子休眠特性及其發(fā)芽方法進(jìn)行了研究[14-15]；朱慧等采用全挖法對(duì)粵東地區(qū)的皺果莧、刺莧、空心蓮子草Alternanthera philoxeroides 3種入侵植物在兩種不同生境下的種群構(gòu)件生物量結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行測(cè)量和比較[16]；鄭卉等基于包括刺莧在內(nèi)的4種莧屬雜草已有的分布點(diǎn)數(shù)據(jù)，使用GARP和Maxent兩個(gè)模型對(duì)其在中國(guó)的適生區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)[17]。王秋實(shí)結(jié)合歷史標(biāo)本信息和野外調(diào)查，對(duì)中國(guó)莧屬植物進(jìn)行了詳細(xì)的經(jīng)典分類(lèi)學(xué)研究，同時(shí)對(duì)其入侵風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估[1]。而對(duì)刺莧和莧屬快速分子鑒定的研究目前尚未有報(bào)道。

目前檢疫鑒定雜草的常用分子生物學(xué)方法主要有以下幾種：限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP），以及應(yīng)用較多的DNA條形碼技術(shù)。如Transue等對(duì)33個(gè)籽粒莧材料進(jìn)行了RAPD解析，結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)吻合[18]；陳景堂等利用RAPD技術(shù)研究了亞洲和中南美洲產(chǎn)的莧屬植物7種14個(gè)品系遺傳關(guān)系[5]。但上述5種方法中，前4種更多的用于種屬間的聚類(lèi)分析比較，較少用于對(duì)某一樣本的種屬鑒定，只有“DNA條形碼技術(shù)”則可直接用于種屬鑒定。所謂“DNA條形碼技術(shù)”就是利用1段至幾段標(biāo)準(zhǔn)的、易擴(kuò)增的、種間差異顯著大于種內(nèi)差異的DNA片段來(lái)鑒別物種的新技術(shù)[19]。該方法已被應(yīng)用到錦葵科Malvaceae植物[20]、蒼耳屬Xanthium spp.植物[21]、毒麥屬Lolium spp.植物[22]以及銀毛龍葵Solanum elaeagnifolium[23]等的鑒定。

本研究在DNA條形碼的基礎(chǔ)上，比較了matK，rpoC1，rpoB，accD及PsbA等基因在莧屬內(nèi)的序列異同(略)，最后在PsbA上找到了適合莧屬及屬內(nèi)刺莧鑒定的引物和探針序列，建立了一種能快速、靈敏、準(zhǔn)確地鑒定刺莧及莧屬植物的新方法——實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定方法。該方法對(duì)刺莧的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.03 ng·μL－1；莧屬的檢測(cè)靈敏度則可達(dá)到0.01 ng·μL－1，足以滿足日常鑒定的檢測(cè)需求。同時(shí)該方法從DNA抽提到獲取實(shí)時(shí)熒光PCR圖譜，整個(gè)過(guò)程可在3 h內(nèi)完成，能達(dá)到快速鑒定入侵雜草刺莧和莧屬植物的目的。實(shí)時(shí)熒光PCR方法適用于植物任何生長(zhǎng)周期和生長(zhǎng)部位，不受實(shí)驗(yàn)材料存活狀態(tài)的影響；同時(shí)可對(duì)疑似目標(biāo)植物殘?bào)w進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足，可作為形態(tài)鑒定的輔助方法，可快速準(zhǔn)確有效地對(duì)刺莧及莧屬植物進(jìn)行鑒定。

[1] 王秋實(shí). 中國(guó)莧屬植物的經(jīng)典分類(lèi)學(xué)研究及其入侵風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[D]. 上海：華東師范大學(xué)，2015：1.

[2] 馬金雙. 中國(guó)外來(lái)入侵植物調(diào)研報(bào)告[M. 北京：高等教育出版社，2014：7－924.

[3] 閆小玲，壽海洋，馬金雙. 中國(guó)外來(lái)入侵植物研究現(xiàn)狀及存在的問(wèn)題[J]. 植物分類(lèi)與資源學(xué)報(bào)，2012，03：287－313.

[4] 萬(wàn)方浩，郭建英，張峰. 中國(guó)生物入侵研究[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009：1－316.

[5] 陳景堂，劉志增，池書(shū)敏. RAPD技術(shù)在幾個(gè)莧屬植物遺傳分類(lèi)中的應(yīng)用研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2001，21（5）：872－878.

[6] 中國(guó)環(huán)境保護(hù)部，中國(guó)科學(xué)院. 中國(guó)第二批外來(lái)入侵物種名單[Z]. 北京：環(huán)發(fā)〔2010〕4號(hào)，2010－1－7. http：//www.zhb.gov.cn/gkml/hbbbwj/201001/t20100126_184831.htm.

[7] 田旭飛. 遼寧省主要入侵植物DNA條形碼技術(shù)體系構(gòu)建[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：1－2.

[8] 伏建國(guó)，楊曉軍，錢(qián)路，等. 植物DNA條形碼技術(shù)在出入境檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 植物檢疫，2012，6（2）：64－69.

[9] PEGELS N，GONZáLEZ I，GARCíA T，et al. Avian-specific real-time PCR assay for authenticity control in farm animal feeds and pet foods[J].Food Chem，2014，142：39－47.

[10] 姜建萍，高雅，朱意麟，等. 刺莧的顯微結(jié)構(gòu)研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)藥，2007，18（11）：2812－2813.

[11] 李潔. 刺莧的化學(xué)成分及生物活性研究[D]. 廈門(mén)：廈門(mén)大學(xué)，2012：1－76.

[12] 陶愛(ài)林，劉林川，王永飛，等. 刺莧花粉泛過(guò)敏原Profilin的抗原性評(píng)估與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2008，28（7）：616－620.

[13] 黃飛龍，馬三梅，陶愛(ài)林，等. 刺莧花粉過(guò)敏原Prf23的表達(dá)優(yōu)化及其免疫學(xué)鑒定[J]. 免疫學(xué)雜志，2009，25（5）：612－613.

[14] 李妮亞，吳艷，李雷，等. 紅瓜、刺莧種子的萌發(fā)特性[J]. 海南師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，14（2）：14－16.

[15] 崔聰淑，盧新雄，陳輝王，等. 野生莧種子休眠特性及發(fā)芽方法研究[J]. 種子，2001，2（114）：55－75.

[16] 朱慧，馬瑞君. 粵東地區(qū)莧科入侵植物種群的構(gòu)件生物量結(jié)構(gòu)[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，23（3）：876－880.

[17] 鄭卉，何興金. 莧屬4種外來(lái)有害雜草在中國(guó)的適生區(qū)預(yù)測(cè)[J]. 植物保護(hù)，2011，37（2）：81－86.

[18] TRANSUE DK，F(xiàn)AIRBANKS D J，ROBISON LR，et al. Species identification by RAPD analysis of grain amaranth genetic resources[J]. Crop Sci，1994，34：1385－1389.

[19] 魏霜，袁俊杰，劉玉莉，等. 檢疫性雜草分子鑒定研究進(jìn)展[J]. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2014（5）：71－74.

[20] 王珂，陳科力，劉振，等. 錦葵科植物DNA條形碼通用序列的篩選[J]. 植物學(xué)報(bào)，2011，46（3）：276－284.

[21] 胡偉毅，汪連軍，盛志超. DNA條形碼基因ITS，ITS2和rbcl在蒼耳屬可采用相同PCR條件[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（16）：7070－7071.

[22] 陳冬美. 毒麥屬6個(gè)種的分子檢測(cè)檢疫應(yīng)用研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[23] 張偉，范曉虹，邵秀玲，等. DNA條形碼在檢疫性雜草銀毛龍葵鑒定中的應(yīng)用研究[J]. 植物檢疫，2013，27（3）：60－65.