李崖雪，高瑞雪，王 豐，劉瀟，李曉陵 ，閆禹竹，王欣波，孫士紅，任佰亮,佟 欣△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛(Trigeminal neuralgia,TN)是神經(jīng)科常見疾病之一，發(fā)病率接近 4.5/100 000[1]。因其發(fā)病機(jī)制不明，故給治療帶來困難。在此疼痛發(fā)生過程中P2Y2受體被激活，進(jìn)而抑制Kv通道亞型表達(dá)，促使三叉神經(jīng)節(jié)(Trigeminal，TG)神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，產(chǎn)生面部疼痛[2]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用電針深刺法上調(diào)電壓門控性鉀通道某些亞型的表達(dá)情況，從而抑制神經(jīng)元興奮性，終止疼痛發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性健康成年。SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

臺式常溫離心機(jī)(Heraeus公司,德國)，Ultrospec 2000紫外分光光度計(jì)(美國公司)，PT-PCR儀(CORBETTRESEARCH公司，澳大利亞),E831型電泳儀(Consort公司,比利時)。

1.3 模型制備

對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，將其固定。右側(cè)顏面去毛、消毒、鋪無菌孔巾。于鏡下眉弓上做弧形切口，露出額骨、眼眶以及鼻骨，撥離眶內(nèi)結(jié)構(gòu)，使眶下神經(jīng)充分暴露，用鑷子緩慢仔細(xì)分離眶下神經(jīng)。結(jié)扎眶下神經(jīng)時采用根鉻腸線2根，力度適中，間距約2 mm。壓力標(biāo)準(zhǔn)：眶下神經(jīng)在鏡下可見不全阻斷其傳導(dǎo)，直徑稍微變細(xì)，神經(jīng)外膜循環(huán)血液通暢。縫合創(chuàng)口置籠內(nèi)觀察。

1.4 模型成立標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)員于造模14天后持塑料棒刺激大鼠患側(cè)面部，大鼠出現(xiàn):①連續(xù)3次或以上非對稱性搔抓面部;②快速抓咬刺激物等攻擊行為;③團(tuán)身向籠壁靠攏或快速后退。上述反應(yīng)如出現(xiàn)其中任意1項(xiàng)或l項(xiàng)以上為造模成功。

1.5 研究方法

將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、電針組和模型組,每組分別為10只。

假手術(shù)組：只進(jìn)行局部皮膚切開(右側(cè))，不結(jié)扎眶下神經(jīng)。

電針組：成模后采用0.18 mm×13 mm華佗牌不銹鋼毫針進(jìn)行針刺，每日2次，半月為一療程。選取百會穴，其方向?yàn)橄蚝笃酱? mm，選取右側(cè)下關(guān)穴，其方向?yàn)橹贝碳s5 mm(盡量靠近三叉神經(jīng)節(jié))，然后連接電針，負(fù)極接主穴即下關(guān)穴，正極接配穴即百會穴，用80 Hz/s連續(xù)波，20 min后停止電針，繼續(xù)留針10 min后出針。

模型組：采用慢性縮窄環(huán)術(shù)結(jié)扎大鼠眶下神經(jīng)制備模型。

1.6 檢測指標(biāo)與方法

采用RT-PCR儀分別檢測3組大鼠TG中Kv1.4mRNA、Kv3.4mRNA、Kv4.2mRNA、Kv4.3mRNA表達(dá)情況。

方法:提取三叉神經(jīng)節(jié)(Trigeminal ganglion,TG)的RNA,溶解在DEPC水20 μL中,然后測吸光值。按照總的RNA濃度,取總RNA1 μg做為模板,并以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR。其中Kv1.4K基因有義鏈引物序列:5′-CATCACTTCCT CCTGCTCTAT-3′,產(chǎn)物377bp,反義鏈引物序列:5′-CAGTTGTTGGCAATCTTCTTC-3′;Akt基因有義鏈引物序列:5′-GGACAACCGCCATCCAGACT-3′,產(chǎn)物121bp,反義鏈引物序列:5′-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3′;內(nèi)參β-actin基因有義鏈引物序列:5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCC-3′,產(chǎn)物217bp,反義鏈引物序列:5′-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′。Akt、PI3K擴(kuò)增條件:先進(jìn)行95℃預(yù)變性，持續(xù)5 min后進(jìn)入30個循環(huán)(56℃1 min,94℃0.5 min,72℃1 min),最后進(jìn)行72℃7 min延伸;β-actinPCR擴(kuò)增條件:先進(jìn)行95℃預(yù)變性，4 min后開始32個循環(huán)(62℃1 min,94℃1 min,72℃2 min),最后10 min72℃延伸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離(在18 g/L瓊脂糖凝膠上)。采用凝膠成像系統(tǒng)對目的電泳條帶進(jìn)行讀取，將各組Kv1.4、Kv3.4、Kv4.2、Kv4.3的灰度值標(biāo)化(以各組β-actin為內(nèi)參)，之后進(jìn)行比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 TG神經(jīng)元中心Kv1.4mRNA、Kv4.3mRNA表達(dá)比較

術(shù)后28天檢測模型組、電針組、假手術(shù)組大鼠TG中Kv1.4mRNA、Kv4.3mRNA表達(dá)的變化,見表1。經(jīng)電針治療后，電針組大鼠TG中Kv1.4mRNA、Kv4.3mRNA與模型組相比表達(dá)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與假手術(shù)組比較未見顯著性差異(P>0.05)。

表1 TG神經(jīng)元中Kv1.4mRNA、Kv4.3mRNA表達(dá)情況比較

注：與模型組比較,*P<0.05；與假手術(shù)組比較,△P>0.05

2.2 TG神經(jīng)元中Kv4.2mRNA、Kv3.4mRNA表達(dá)比較

術(shù)后28天檢測模型組、電針組、假手術(shù)組大鼠TG中Kv4.2mRNA、Kv3.4mRNA表達(dá)的變化,見表2。經(jīng)電針治療后，電針組大鼠TG中Kv4.2mRNA、Kv3.4mRNA與模型組相比表達(dá)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與假手術(shù)組比較未見顯著性差異(P>0.05)。

表2 TG神經(jīng)元中Kv4.2mRNA、Kv3.4mRNA表達(dá)情況比較

注：與模型組比較,*P<0.05；與假手術(shù)組比較,△P>0.05

3 討論

本項(xiàng)研究選取“下關(guān)穴”為主穴，基于此穴為傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)效穴[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上“下關(guān)穴”所在的特殊解剖位置，其下方靠近三叉神經(jīng)半月節(jié)所在處，此神經(jīng)節(jié)受壓，脫髓鞘，進(jìn)而發(fā)生神經(jīng)電生理變化正是本病發(fā)生機(jī)理(神經(jīng)壓迫學(xué)說)[4-5]，同時采用深刺方法，力求最大可能接近三叉神經(jīng)半月節(jié)，達(dá)到對此節(jié)最大刺激量，糾正電生理改變，恢復(fù)其功能。選用“百會穴”為配穴，因其為諸陽之會，總督一身陽經(jīng)經(jīng)氣，可疏通面部疼痛部位氣血，通經(jīng)而止痛。此研究運(yùn)用電針深刺法將治療本病的經(jīng)驗(yàn)效穴與具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)的電針[6-8]方法相結(jié)合，結(jié)果證實(shí)此方法可明顯緩解三叉神經(jīng)痛大鼠疼痛。

在三叉神經(jīng)痛發(fā)生過程中電壓門控性鉀通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程中起到重要作用[9-10]。研究表明，在三叉神經(jīng)痛發(fā)作時起作用最明顯且最相關(guān)的是IA[11]，介導(dǎo)IA的Kv亞型主要是Kv3.4、Kv1.4、Kv4.3以及Kv4.2[12]。鉀通道Kv4.3、Kv1.4、Kv4.2、Kv3.4介導(dǎo)IA，通過對IA抑制劑的敏感與否，區(qū)分鉀通道其它類型[13]。李娜等研究表明在三叉神經(jīng)痛發(fā)生過程中P2Y2 受體被激活，進(jìn)而抑制Kv通道亞型表達(dá)，促使TG神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，產(chǎn)生面部疼痛。本研究于術(shù)后28天采用PT-PCR技術(shù)分別檢測假手術(shù)組、電針組、模型組大鼠TG中Kv4.3、Kv1.4、Kv4.2、Kv3.4mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)電針深刺治療后，電針組大鼠TG中Kv4.3、Kv1.4、Kv4.2以及Kv3.4mRNA與模型組相比表達(dá)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。說明此方法可以通過增加Kv通道亞型表達(dá)，抑制神經(jīng)元興奮性，終止三叉神經(jīng)痛發(fā)生，進(jìn)一步闡明此法治療三叉神經(jīng)痛的分子機(jī)制。

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