□ 王志強(qiáng) 亳州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所

1 PCR技術(shù)的原理

在長(zhǎng)期的發(fā)展中，PCR技術(shù)大致可以劃分為3類(lèi)，即熒光定量PCR檢測(cè)、多重PCR檢測(cè)以及常規(guī)PCR檢測(cè)。這三種PCR檢測(cè)技術(shù)是不斷改進(jìn)和提升的，如下圖1所示。

1.1 常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)

這種技術(shù)通常又稱(chēng)為傳統(tǒng)PCR技術(shù)，其原理為，以熱穩(wěn)定DNA聚合酶為催化劑，并以DNA模板、適當(dāng)緩沖液、引物、dNIP以及MgC12溶液為反應(yīng)混合物，對(duì)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。這種技術(shù)是最早發(fā)展起來(lái)的，多重PCR檢測(cè)技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)是在這種技術(shù)的基礎(chǔ)上派生出來(lái)的。

1.2 多重PCR檢測(cè)技術(shù)

這種技術(shù)的檢測(cè)原理和常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)存在類(lèi)似的地方，兩者的區(qū)別在于，如果存在與引物的特異性互補(bǔ)的模板，需要在同一反應(yīng)體系中，加入一對(duì)以上的特異性引物。這種技術(shù)的特點(diǎn)是系統(tǒng)性、簡(jiǎn)便性、高效性、經(jīng)濟(jì)性，即檢疫系統(tǒng)完備、操作簡(jiǎn)單、執(zhí)行快速以及成本低廉，是食品檢測(cè)中一種十分重要的技術(shù)。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

這一技術(shù)是新近發(fā)展起來(lái)的，其原理是在常規(guī)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀中使用熒光能量傳遞技術(shù)，在某種化學(xué)作用下產(chǎn)生效果。從檢測(cè)PCR的過(guò)程得知靶序列初始濃度，并將能量轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度和DNA產(chǎn)量之間是正比例關(guān)系，最終實(shí)現(xiàn)定量目的。熒光定量檢測(cè)技術(shù)是在常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)和多重PCR檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)，進(jìn)行了改進(jìn)和創(chuàng)新。這種技術(shù)主要通過(guò)電腦軟件進(jìn)行檢測(cè)和獲取結(jié)果，因此不需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行再一次的檢測(cè)，避免對(duì)環(huán)境的污染。此外它還具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)一管多檢。

2 PCR檢測(cè)技術(shù)在食品檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用

2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用

這種技術(shù)是在1985年發(fā)明的，早期主要在轉(zhuǎn)基因和基因克隆中使用，具有快速、精確等優(yōu)勢(shì)，在其他引領(lǐng)也獲得廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，在食品檢測(cè)中獲得應(yīng)用，具體包括轉(zhuǎn)基因食品鑒定、食品成分種類(lèi)檢測(cè)、食源性致病菌檢測(cè)以及食品有效成分檢測(cè)。這種技術(shù)用來(lái)檢測(cè)水體微生物，尤其是生活在水中的微生物。

這種技術(shù)還可以用來(lái)檢測(cè)食品樣品中的致病菌，具體包括2個(gè)步驟：第一步，使用過(guò)濾或者離心方式獲得樣品中的細(xì)菌細(xì)胞，然后將DNA抽取出來(lái)；第二步，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解，并進(jìn)行核酸純化。如圖2所示。

2.2 多重PCR檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用

圖1 PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)展示意圖

圖2 常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)致病菌檢測(cè)步驟

這種技術(shù)和常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)比較，具有擴(kuò)增效率高、經(jīng)濟(jì)方便、特異性高等優(yōu)勢(shì)。這一技術(shù)最早是在1988年提出的，并最早在生物醫(yī)藥領(lǐng)域使用，近年來(lái)，這種技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)。徐曉可等[1]建立了食品中金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)研究結(jié)果，她所建立的檢測(cè)技術(shù)的靈敏度高于傳統(tǒng)檢測(cè)方式，可以很好地用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)；Ryu等[2]通過(guò)擴(kuò)增斯氏李斯特式菌、伊式李斯特式均、格式李斯特式菌、無(wú)害式李斯特式菌、威式李斯特式菌以及L-單核細(xì)胞增生李斯特式菌的特異性片段，建立多重PCR檢測(cè)方式。

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用

其一，轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在分子水平上，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成本檢測(cè)的精確度十分高，因此在轉(zhuǎn)基因成因的定性、品系鑒定和含量檢測(cè)中得到廣泛使用。隨著技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)前，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)和高通量測(cè)序、基因芯片等技術(shù)結(jié)合在一起，用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)。

其二，食品中動(dòng)植物源性檢測(cè)。當(dāng)前，在食品市場(chǎng)中，摻假、摻雜等現(xiàn)象十分突出，由于受到利益的驅(qū)使，一些生產(chǎn)商使用成本很低的材料，獲取高額利潤(rùn)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，多是建立在對(duì)物種蛋白質(zhì)的分析上，然后利用免疫學(xué)技術(shù)對(duì)性源成分進(jìn)行確定。而熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)以DNA分子鑒定為主，具有種間特異性強(qiáng)、種內(nèi)保守性高、穩(wěn)定性高的優(yōu)勢(shì)，可以單獨(dú)作為物種判斷依據(jù)。

[1]劉賽.PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用探究[J].糧食流通技術(shù),2016(17):44-46.

[2]秦廣闊. PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)科技投資,2017(14).