張鴻翔 林睿 蒙清貴 張慶云 易賢林 程繼文

前列腺癌是我國男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，發(fā)病數(shù)量近年呈不斷上升趨勢(shì)［1-2］。研究表明遺傳因素是前列腺癌發(fā)病的最重要因素［3］，而不同種族中疾病的易感基因不盡相同。在中國人群［4］、非洲裔美國人群［5-6］、韓國人群［7］、澳大利亞人群［8］中均發(fā)現(xiàn)與前列腺癌發(fā)生有關(guān)的易感基因，但目前為止，尚未有針對(duì)中國壯族前列腺癌人群易感基因的相關(guān)研究。本研究通過對(duì)壯族人群前列腺癌患者癌組織及其癌旁組織進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，進(jìn)一步篩選候選基因，找出可能與前列腺癌易感性有關(guān)的突變基因，以期探索前列腺癌的發(fā)病病因。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2013年7月至2016年11月收治的26例壯族前列腺癌患者。所有患者均經(jīng)經(jīng)直腸前列腺穿刺活檢術(shù)、經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)或前列腺癌根治術(shù)獲得病理組織證實(shí)。26例患者分別取其癌組織及其癌旁組織，其中26例癌組織作為病例組，26例癌旁組織作為對(duì)照組。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，患者及家屬均知情同意書。

1.2 主要材料與儀器

DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；熒光定量儀購自美國Life Invitrogen公司；NanoDrop One超微量紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher公司；文庫制備試劑盒、文庫量化試劑盒、快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶購自美國KAPA Biosystems公司；Bioruptor Pico超聲波破碎儀購自比利時(shí)Diagenode公司；Agencourt AMPure XP磁珠純化試劑盒購自美國beckman公司；人cot-1 DNA購自美國Life Technologies公司；NimbleGen SeqCap EZ雜交、洗滌試劑盒購自瑞士Roche公司；Agilent Technologies 2100生物分析儀購自美國Agilent Tech-nologies公司；HiSeq NGS平臺(tái)購自美國Illumina公司；xGen通用阻斷寡核苷酸購自美國Integrated DNA Technologies公司。

1.3 基因測(cè)序

1.3.1 基因組DNA提取 26例前列腺癌患者癌組織及癌旁組織采用DNA提取試劑盒提取DNA，Qubit 3.0熒光定量儀和NanoDrop One超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和質(zhì)量控制。

1.3.2 文庫準(zhǔn)備 采用超聲波破碎儀將基因組DNA剪切成350 bp片段后純化，依次進(jìn)行末端修復(fù)，加dA尾，磁珠純化后加入連接接頭，再次進(jìn)行磁珠純化。通過PCR擴(kuò)增文庫并純化目標(biāo)富集。

1.3.3 雜交捕獲和測(cè)序 將DNA文庫與Agilent WES探針加入雜交體系完成雜交。鏈霉素親和素磁珠捕獲反應(yīng)。捕獲的文庫在快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶中用Illumina p5（序列：5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'）和 p7（5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3'）引物在磁珠上擴(kuò)增，純化捕獲后的擴(kuò)增文庫，qRT-PCR定量。文庫片段大小由Agilent Technologies 2100生物分析儀測(cè)定。根據(jù)說明書在HiSeq NGS平臺(tái)對(duì)富含目標(biāo)的文庫進(jìn)行測(cè)序，組織樣本平均測(cè)序深度不低于1000×，ctDNA樣本平均測(cè)序深度不低于5000×。測(cè)序工作由南京世和基因生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 采用Trimmomatic軟件對(duì)FASTQ文件進(jìn)行質(zhì)量控制，Burrows-Wheeler Aligner（BWA-mem，v0.7.12）軟件將來自每個(gè)樣本的讀數(shù)映射到參考的人類基因組hg19，VarScan2軟件檢測(cè)體細(xì)胞突變，ANNOVAR對(duì)參考基因組hg19和2014版標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫和功能預(yù)測(cè)程序進(jìn)行注釋。通過生物信息學(xué)分析腫瘤組織DNA基因融合突變、基因拷貝數(shù)變化、點(diǎn)突變、堿基插入缺失突變等各種類型，通過與陰性對(duì)照對(duì)比去除種系突變，篩選出腫瘤特有突變。

1.4 候選基因篩查

將每個(gè)患者篩選出的腫瘤特有突變結(jié)果匯總，根據(jù)腫瘤樣本覆蓋深度（TUMOR.DP）、腫瘤樣本突變堿基深度（TUMOR.AD）、腫瘤樣本突變堿基頻率（TUMOR.AF）等指標(biāo)篩選可能與前列腺癌有關(guān)的突變基因，再根據(jù)26對(duì)癌組織對(duì)比癌旁組織的共有突變篩選出排在前60位的SNP，并用R軟件繪圖，通過DAVID在線功能通路富集數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）［9］和人類基因變異與臨床信息整合數(shù)據(jù)庫［10］（http：//varcards.biols.ac.cn/）篩選出最有可能導(dǎo)致前列腺癌的突變基因。將篩選到的前列腺癌致病基因?qū)?yīng)本研究中全外顯子組測(cè)序結(jié)果，經(jīng)相同的篩查策略，同時(shí)使用連鎖不平衡計(jì)算軟件SNAP（http：//archive.broadinstitute.org/mpg/snap）計(jì)算 SNP間的 r2，若r2<0.7則確定為候選的基因變異位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 26例前列腺癌患者的基線資料

26例患者年齡47～83 歲，平均年齡（68.57±9.93）歲，平均前列腺特異性抗原為（844.31±2787.13）ng/mL。高危（格里森評(píng)分≥8分）前列腺癌16例，中危（格里森評(píng)分=7分）8例，低危（格里森評(píng)分≤6分）2例；腫瘤TNM分期中T1～T4期分別為0例、13例、5例、8例。

2.2 基因測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

各樣本基因測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制如圖1所示，Q20為（94.88±1.10%），Q30為（89.10%±2.30%），說明檢測(cè)結(jié)果可靠。

圖1 基因測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

2.3 候選基因篩查

26例前列腺癌患者的癌組織及癌旁組織進(jìn)行全外顯子測(cè)序，通過質(zhì)量控制捕獲到48 882個(gè)SNP。候選基因篩查流程如下：⑴保留不在重復(fù)序列基因組區(qū)域、位于剪接區(qū)域或外顯子區(qū)域能引起氨基酸變化的位點(diǎn)，剔除常見的基因變異（最小等位基因頻率>1%），保留經(jīng) SIFT、Polyphen、MutationTaster 或CADD軟件預(yù)測(cè)有害者，篩選到20 174個(gè)SNP；⑵保留 TUMOR.DP ≥15、TUMOR.AD ≥3、TUMOR.AF ≥5%、對(duì)照樣本覆蓋深度（CONTROL.DP）≥10、對(duì)照樣本突變堿基深度（CONTROL.AD）≤2者，篩選到17 281個(gè)SNP；⑶進(jìn)一步剔除常見的堿基變異，要求變異位點(diǎn)上突變堿基在千人基因組計(jì)劃所有人群及東亞人群數(shù)據(jù)中的等位基因頻率≤5%，篩選到2 621個(gè)SNP；⑷用Polyphen2軟件預(yù)測(cè)變異對(duì)蛋白序列的影響，如結(jié)果顯示為“有害”或者“可能有害”，則保留該變異位點(diǎn)，篩選到419個(gè)SNP；⑸進(jìn)一步用Mutation Taster軟件預(yù)測(cè)變異對(duì)蛋白序列的影響，保留顯示“引起疾病發(fā)生”者，篩選到288個(gè)SNP；⑹根據(jù)變異類型保留錯(cuò)義突變、框內(nèi)缺失、框內(nèi)插入、移碼突變、剪接供體突變和剪接受體突變。最終篩選到284個(gè)候選SNP。

284個(gè)候選SNP按照共有突變比例大小進(jìn)行排位，排在前60位（TOP 60）SNP的基因共變異圖如圖2所示。通過DAVID在線功能通路富集數(shù)據(jù)庫以及人類基因變異與臨床信息整合數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步查找各突變基因與疾病的關(guān)系。如檢索到基因在通路中參與癌癥的發(fā)生發(fā)展或在臨床中被證實(shí)為致病基因，則確定為本研究的候選基因。最終發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1基因（low density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1）突變可能與前列腺癌有關(guān)，且26例前列腺癌中有23.1%的患者LRP1基因突變。其中SNP chr12：57556206（rs769851229）為人類基因變異與臨床信息整合數(shù)據(jù)庫中檢索到的致病位點(diǎn)，新發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNP（chr12：57603908、chr12：57548363、chr12：57567636、chr12：57554683、chr12：57549979）可能與前列腺癌發(fā)生有關(guān)，連鎖不平衡分析顯示，各位點(diǎn)均與SNPchr12：57556206位點(diǎn)相互獨(dú)立（r2<0.7）。見表1。

圖2 26例前列腺癌患者的基因共變異圖

表1 新發(fā)現(xiàn)的位于LRP1基因可能與前列腺癌相關(guān)的SNP位點(diǎn)

3 討論

目前全基因組關(guān)聯(lián)分析已成功發(fā)現(xiàn)超過100個(gè)SNP位點(diǎn)與前列腺癌有關(guān)，這些變異位點(diǎn)多為位于內(nèi)含子的常見變異［11］，而對(duì)于具有編碼功能的外顯子有關(guān)研究較少。全外顯子組測(cè)序可針對(duì)基因組中的蛋白質(zhì)編碼區(qū)靶向富集外顯子區(qū)域測(cè)序，越來越多的研究通過該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了人類基因組中與各種復(fù)雜疾病相關(guān)的易感基因［12］。本研究對(duì)26例壯族前列腺癌患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序，以尋找前列腺癌組織的突變基因。

LRP1是屬于低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）受體家族的內(nèi)吞受體，介導(dǎo)多種細(xì)胞外配體的內(nèi)吞作用［13］。由LRP1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用可清除基質(zhì)中過多的蛋白水解酶，從而阻止基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)分解。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外蛋白水解活性，LRP1基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、遷移、組織修復(fù)和重塑、腫瘤進(jìn)展和侵襲中具有重要作用。Benes等［14］研究發(fā)現(xiàn)LRP1基因多態(tài)性與白人女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。在某些腫瘤細(xì)胞中，抑制細(xì)胞膜表面LRP1的表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［15］。而通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，LRP1可控制細(xì)胞的多個(gè)生理活動(dòng)，如促進(jìn)細(xì)胞間相互作用［16-17］。Langlois等［18］研究發(fā)現(xiàn) LRP1 可增強(qiáng)腫瘤侵襲能力。Kluth等［19］對(duì)500例前列腺癌組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LRP1基因重排1例，亦說明LRP1基因突變可能與前列腺癌易感性有關(guān)。本研究對(duì)26例壯族前列腺癌患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序，通過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和篩查策略，最終篩選出最有可能導(dǎo)致前列腺癌的TOP 60基因，再通過DAVID在線功能通路富集數(shù)據(jù)庫以及人類基因變異與臨床信息整合數(shù)據(jù)庫查找TOP 60基因中與疾病發(fā)生相關(guān)的基因，最終發(fā)現(xiàn)LRP1基因突變可能與前列腺癌有關(guān)。

前列腺癌發(fā)病有明顯地域和種族差異，研究者認(rèn)為這種差異可能是由環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果。在美國，非洲裔美國人群的前列腺癌患病率和死亡率分別比白種人群高58%和144%［20］。前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也與SNP相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)超過100個(gè)與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的SNP，但無LRP1基因。而漢族與壯族人群也存在SNP差異性，李麗蘭等［21］研究發(fā)現(xiàn)漢族、壯族人群中HNA基因頻率分布均有其獨(dú)特特征。黃瓊?cè)A等［22］研究發(fā)現(xiàn)microRNA-146a基因rs 2910164位點(diǎn)的CG基因型可能是廣西壯族人群肝癌發(fā)病的遺傳易感因素之一。但目前尚未有針對(duì)中國壯族前列腺癌人群易感基因的相關(guān)研究。本研究26例前列腺癌患者中，23.1%的患者檢測(cè)到LRP1基因突變，且人類基因變異與臨床信息整合數(shù)據(jù)庫表明LRP1基因的chr12：57556206位點(diǎn)是致病位點(diǎn)，新發(fā)現(xiàn)的LRP1基因 chr12：57603908、chr12：57548363、chr12：57567636、chr12：57554683、chr12：57549979 等 5 個(gè)位點(diǎn)可能與前列腺癌發(fā)生有關(guān)，且各位點(diǎn)均與chr12：57556206位點(diǎn)相互獨(dú)立，再次提示LRP1基因突變可能與前列腺癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但本研究樣本量較小，有關(guān)結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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