何盼 范倪 陳思 唐艷萍 李科志 楊春 黃小青 曹驥

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率與死亡率居高不下，但目前發(fā)病機制未明確［1］。本課題組前期采用RNA-Seq技術(shù)，對人肝癌組織及相應癌旁組織和正常肝組織，以及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和黃曲霉毒素 B1（aflatoxins，AFB1）誘發(fā)的樹鼩肝癌、癌旁和正常肝組織標本進行全轉(zhuǎn)錄組測序、基因表達水平分析和比較，發(fā)現(xiàn)人肝癌和樹鼩肝癌共同差異表達基因載脂蛋白F（apoipoprotein F，APOF）和人胰島素樣生長因子酸不穩(wěn)定亞基（the insulinlike grouth factor binding protein acid labile subunit，IGFALS）的mRNA表達水平在肝癌組織中均下調(diào)，推測兩者可能是影響肝癌發(fā)生發(fā)展的重要分子［2］。本研究在此基礎上進一步采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測APOF和IGFALS基因在人肝癌組織、相應癌旁組織及正常肝組織中mRNA的表達水平，并分析兩者與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系，探討APOF、IGFALS基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究選取2014年1月1日至2015年12月30日于廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除及病理確診為原發(fā)性肝癌的患者，取其肝癌組織及相應癌旁組織（距離癌灶>5 cm），各88例，并選取同期經(jīng)病理確診的非肝癌患者切除的正常肝組織6例。所有患者HBsAg均陽性，術(shù)前均未行放化療或靶向治療，平均年齡（47.4±9.6）歲，其中男性80例，女性14例；血甲胎蛋白（AFP）水平>400 ng/mL 36例；腫瘤直徑>5 cm 69例；BCLC分期A期23例、B期18例、C期47例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 主要材料與引物設計

總RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR檢測試劑盒均由廣西鴻速科技發(fā)展有限公司提供。APOF基因、IGFALS基因和GAPDH基因引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)Genebank人類APOF、IGFALS和GAPDH基因的cDNA序列，應用Primer 5.0軟件設計引物。APOF基因上游引物序列為5'-AGGCTGATGTTTGGGCTCTA-3'，下游為 5'-CGTTCCTCTCTGTGCTTCTG-3'，擴增片段為 117 bp；IGFALS基因上游引物序列為5'-CATTGCCCAACAGCCTC-TTG-3'，下游為 5'-GTGAAGGTCCGCAGTGAGTT-3'，擴增片段為79 bp；內(nèi)參GAPDH基因上游引物序列為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，擴增片段為 121 bp。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

取約0.5 g標本放入1 mL Trizol試劑剪碎，勻漿后置于低溫離心機，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清液置于EP管；加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15s后冰上放置5min；加入等體積異丙醇，混勻后冰上放置10 min，棄上清液，加入75% 乙醇1 mL，振蕩1 min，4℃ 12 000 r/min離心 5 min，棄上清液，自然干燥5～10 min，混勻，檢測其濃度和純度，凝膠電泳系統(tǒng)檢測總RNA完整性。按照試劑盒說明書將上述提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，配制反應體系，操作于冰上進行。

1.4 qRT-PCR法檢測APOF和IGFALS基因mRNA相對表達量

采用Real-TimePCRSystem擴增。冰上配制10μL PCR 反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ5 μL，PCR 上、下游引物（10 μmol/L）各 0.4 μL，模板（cDNA 溶液）1 μL，ROX Reference Dye（50×）0.2 μL，滅菌蒸餾水3 μL。PCR反應條件：95℃ 5 s，60 ℃退火 30 s，共 40個循環(huán)。同時擴增各樣本的目的基因和內(nèi)參基因，每組設置3個復孔。通過管家基因GAPDH進行水平校正，采用2-△△Ct法計算APOF及IGFALS mRNA的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計學意義，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)。計數(shù)資料兩個樣本率的比較采用χ2檢驗。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1APOF和IGFALS mRNA在肝癌組織中的表達

肝癌組織中APOF mRNA相對表達量低于癌旁組織和正常肝組織（0.156±0.019 vs 0.971±0.010，P<0.001；0.156±0.019 vs 81.140±0.092，P<0.001）；肝癌組織中IGFALS mRNA相對表達量亦低于癌旁組織及正常肝組織（0.111±0.016 vs 1.090±0.054，P<0.001；0.111±0.016

vs 1.101±0.211，P<0.001）；APOF 和 IGFALS mRNA 在癌旁組織和正常肝組織中的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.2 肝癌組織中APOF和IGFALS mRNA表達與患者臨床病理特征的相關(guān)性

根據(jù)APOF mRNA平均表達水平（0.156）和IGFALS mRNA平均表達水平（0.111），分別將肝癌患者分為APOF高表達（>0.156）組36例及低表達（≤0.156）組52例，IGFALS高表達（>0.111）組 28例及低表達（≤0.111）組60例。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，APOF mRNA表達與門靜脈侵犯相關(guān)（P=0.004）；IGFALS mRNA表達與腫瘤分化程度、門靜脈侵犯相關(guān)（P<0.05）。見表1。

圖1 APOF和IGFALS mRNA在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達

表1 肝癌組織中APOF和IGFALS mRNA表達與患者臨床病理特征的關(guān)系（n）

（續(xù)表）

2.3 肝癌組織中APOF和IGFALS mRNA表達的相關(guān)性

在肝癌組織中，APOF mRNA表達水平和IGFALS mRNA 表達水平呈正相關(guān)（r=0.332，P<0.01），見圖 2。

圖2 肝癌組織中APOF與IGFALS mRNA表達的相關(guān)性

3 討論

胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）信號通路對惡性細胞增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移有重要調(diào)節(jié)作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Gu等［3］報道IGFALS可能通過調(diào)節(jié)循環(huán)中IGF-1和IGFBP-3水平參與前列腺癌和乳腺癌發(fā)生。但游離的IGFs半衰期非常短，不足以維持其到達靶器官發(fā)揮作用。IGFALS可與IGFs及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3/5（insulinlike growth factor binding protein-3/5，IGFBP-3/5）結(jié)合，形成異源三聚體復合物，延長IGFs在血液中的半衰期功能，是血清中IGF-1和IGFBP-3累積的必要條件［4］。Neumann等［5］發(fā)現(xiàn)IGFALS在肝癌中作為腫瘤抑制因子，其下調(diào)可引起HCC中IGF-Ⅱ信號傳導失調(diào)，促進癌細胞增殖。Marquardt等［6］發(fā)現(xiàn)IGFALS在肝癌中表達下調(diào)。同時循環(huán)中APOF水平與乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤發(fā)病風險相關(guān)［7-8］，但目前APOF與肝癌的相關(guān)報道較少。

本研究檢測肝癌組織、相應癌旁組織及正常肝組織中APOF和IGFALS基因mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)APOF和IGFALS mRNA在肝癌組織中的表達水平均低于癌旁組織和正常肝組織，提示APOF、IGFALS低表達可能與肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。進一步對88例肝癌組織中APOF與IGFALS mRNA表達量進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)APOF與IGFALS mRNA表達量呈正相關(guān)。提示APOF和IGFAL在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能具有協(xié)同作用，有關(guān)方面值得進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)APOF mRNA表達與肝癌患者門靜脈侵犯有關(guān)；IGFALS mRNA表達與腫瘤分化程度、門靜脈侵犯相關(guān)，提示APOF、IGFALS基因表達降低可能導致肝癌患者病情進展。Franklin等［9］報道IGFBP3在前列腺癌血管生成中具備雙重作用，而肝癌中IGFALS下調(diào)可引起IGFBP3下調(diào)［4］，可能對血管生成具有調(diào)控效應，進而與門靜脈侵犯相關(guān)。

綜上所述，APOF與IGFALS基因在人肝癌組織中表達下調(diào)，二者表達呈正相關(guān)，且其表達水平與門靜脈侵犯有關(guān)，APOF與IGFALS或可作為評估肝癌進展的指標，兩者可能協(xié)同作用共同參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體機制仍有待研究。

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