伊雪梅 薛麗 張婧 喬玉潔 靳倩倩 李紅玲

外周T細(xì)胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma，PTCL）是一組起源于胸腺后成熟T淋巴細(xì)胞的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國占非霍奇金淋巴瘤的15%～22%［1］，侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，治療效果差。有文獻(xiàn)報道，氧化應(yīng)激所致的氧化損傷可能與淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［2］。核因子 E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-relatedfactor-2，Nrf2）是抗氧化應(yīng)激過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，Nrf2被激活后可發(fā)揮抗氧化損傷作用。近年研究發(fā)現(xiàn)Nrf2蛋白持續(xù)異常激活與腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)［3-6］。目前Nrf2僅在淋巴瘤細(xì)胞株中有少許研究，在淋巴瘤組織中尚缺乏相關(guān)研究。本研究采用免疫組化法檢測Nrf2在PTCL組織中的表達(dá)，分析其與PTCL臨床病理特征的關(guān)系，以期為PTCL治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年10月至2016年12月在甘肅省人民醫(yī)院確診的PTCL患者石蠟標(biāo)本24例（PTCL組），根據(jù)2016版WHO淋巴瘤分類，非特指型8例、ALK（-）間變大細(xì)胞淋巴瘤4例、ALK（+）間變大細(xì)胞淋巴瘤7例、血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤4例、腸病相關(guān)T細(xì)胞淋巴瘤1例。男性13例，女性11例；年齡7～81歲（中位年齡49.5歲），≤45歲9例，>45歲15例。選取同期淋巴結(jié)反應(yīng)性增生石蠟標(biāo)本17例為對照組，年齡16～70歲（中位年齡41歲）。診斷參照《淋巴瘤病理診斷標(biāo)準(zhǔn)》［7］，所有患者病例資料完整。排除合并其他惡性腫瘤、急性感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、年齡相關(guān)性黃斑變性、白內(nèi)障、急性心肌梗死或急性腦梗死者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及方法

兔抗人Nrf2多克隆抗體（rabbit anti-Nrf2 antibody，bs-1074R）、免疫組化SP試劑盒、DAB染色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。所有組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，片厚4 μm，行免疫組化染色。SP法免疫組化染色嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，Nrf2試劑工作濃度1∶400。所有切片通過檸檬酸緩沖液煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷

由2位病理科醫(yī)師雙盲閱片，評估染色結(jié)果。根據(jù)文獻(xiàn)［8-9］方法，在高倍鏡（×400）下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，每個標(biāo)本計數(shù)3張切片，每張切片隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)100個細(xì)胞數(shù)/視野。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比評分：≤5%為 0分，6%～25%為1分，26%～50%為 2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，弱染色（淺黃色）為1分，中度染色（棕黃色）為2分，強(qiáng)染色（棕褐色）為3分。根據(jù)鏡下陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度評分的乘積作為染色指數(shù)評分，分為以下4級：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽性（+）；5～8分為陽性（++）；9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。本研究以+～+++為陽性表達(dá)。

惡性淋巴瘤根據(jù)患者有無全身癥狀，分為A、B組；當(dāng)出現(xiàn)原因不明反復(fù)發(fā)熱（常在38℃以上）、盜汗、6個月內(nèi)體重減少超過10%，出現(xiàn)以上任一癥狀者為B組（即B癥狀）；A組即無上述任一癥狀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間陽性率比較采用連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nrf2在PTCL組織和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，Nrf2陽性表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞核為主，呈棕黃色或棕褐色顆粒。Nrf2在PTCL組織和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中的陽性表達(dá)率分為 41.67%（10/24）、5.88%（1/17），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.796，P=0.029）。見圖 1、表1。

表1 Nrf2在PTCL組織和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中的表達(dá)

圖1 PTCL組織和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中Nrf2的表達(dá)（SP，×400）

2.2 PTCL組織中Nrf2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在PTCL組織中Nrf2的表達(dá)水平與患者性別、年齡及乳酸脫氫酶水平（lactate dehydrogenase，LDH）水平無關(guān)（P>0.05），與臨床分期、B癥狀有關(guān)（P＜0.05）。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的患者Nrf2陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期者（75.00%vs 8.33%，P＝0.003）。Nrf2在有B癥狀患者中的陽性表達(dá)率高于無B癥狀患者（64.29%vs 10.00%，P=0.013），見表2。

表2 Nrf2表達(dá)與PTCL患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

Nrf2是一種堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，1994年由Moi等［10］首次報道。研究發(fā)現(xiàn) Nrf2與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。毛景濤等［11］在食管鱗狀細(xì)胞癌研究中發(fā)現(xiàn)Nrf2主要表達(dá)于細(xì)胞核，散在分布于細(xì)胞質(zhì)，在癌組織中陽性表達(dá)率高于癌旁組織，且Nrf2表達(dá)水平可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在胃癌、膽囊癌、胰腺癌、卵巢癌等［12-14］研究中亦發(fā)現(xiàn)Nrf2表達(dá)升高，Nrf2異常持續(xù)激活不僅與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療藥物耐藥有關(guān)，且可促進(jìn)腫瘤生長，導(dǎo)致預(yù)后不良。亦有研究報道，氧化應(yīng)激與急性髓系白血病復(fù)發(fā)和預(yù)后不良有關(guān)［15］。Zha等［16］研究發(fā)現(xiàn)抑制Nrf2表達(dá)可促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞凋亡。Chen等［17］發(fā)現(xiàn)Nrf2表達(dá)升高可能與套細(xì)胞淋巴瘤對硼替佐米耐藥有關(guān)。上述研究結(jié)果提示，不管實(shí)體瘤還是血液系統(tǒng)惡性腫瘤，Nrf2均存在異常表達(dá)，且其高表達(dá)可能與腫瘤耐藥及不良預(yù)后有關(guān)。

關(guān)于Nrf2在PTCL組織中的表達(dá)，目前尚未見報道。本研究通過免疫組化SP法檢測，發(fā)現(xiàn)Nrf2在外周T細(xì)胞淋巴瘤組織中呈高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核，散見于細(xì)胞質(zhì)，與文獻(xiàn)［11］報道一致。進(jìn)一步分析Nrf2表達(dá)與PTCL患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Nrf2表達(dá)與PTCL分期有關(guān)，分期越晚Nrf2陽性表達(dá)率越高，分析原因可能與Nrf2對不同分期PTCL患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的反應(yīng)不同有關(guān)。在膽囊癌研究中［18］亦發(fā)現(xiàn)Nrf2表達(dá)與其分期密切相關(guān)，考慮可能與Nrf2持續(xù)激活，且調(diào)控下游抗氧化物酶大量表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制仍有待研究。因本研究樣本量較少，且未行生存分析，有關(guān)結(jié)論尚需進(jìn)一步。

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