蔣群湘 魏斐斐 王洪學(xué) 郭輝 謝裕安

廣西地區(qū)2013年惡性腫瘤登記資料統(tǒng)計(jì)分析顯示，肝癌發(fā)病率和病死率在廣西地區(qū)均居第二位［1］。個(gè)體基因遺傳多態(tài)性在肝癌發(fā)病中起重要作用，部分研究顯示肝癌發(fā)病存在顯著家系聚集性傾向［2-4］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是肝癌遺傳易感性研究的基礎(chǔ)條件，同時(shí)可解釋遺傳易感性在個(gè)體中的差異性［5-7］。生長(zhǎng)激素受體（growth hormone receptor，GHR）與肝癌［8］、結(jié)直腸癌［9］等惡性腫瘤有關(guān)。但目前關(guān)于GHR SNP與肝癌遺傳易感性的研究較少。本研究以廣西扶綏縣25個(gè)肝癌家系和17個(gè)健康對(duì)照家系為研究對(duì)象，分析GHR基因位點(diǎn)多態(tài)性與肝癌遺傳易感性的關(guān)系，以期為肝癌發(fā)生機(jī)制研究、診斷及預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象

本研究對(duì)象均選自長(zhǎng)期生活在廣西扶綏縣的人群，包括25個(gè)肝癌家系和17個(gè)健康對(duì)照家系，其中肝癌家系中肝癌患者25例（肝癌家系肝癌組）、肝癌患者直系親屬但非肝癌者81名（肝癌家系非肝癌組）。所有肝癌患者均于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行外科手術(shù)治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肝細(xì)胞癌，肝癌家系非肝癌組成員均經(jīng)病史采集顯示其直系親屬中至少1人確診為肝細(xì)胞癌。肝癌家系中男性 61例，女性 45例，平均年齡（44.55±15.41）歲；飲酒（≥100 g/d）20例，不飲酒（＜100 g/d）86例；吸煙（≥10支/d）25例，不吸煙（＜10支/d）81例；HBsAg（+）55例，HBsAg（-）51例；AFP（+）14例（均肝癌患者），AFP（-）92 例。

健康對(duì)照家系入選80名（對(duì)照組），均為與肝癌家系居住在同一個(gè)村或生活環(huán)境相似的鄰近村，且與肝癌家系無血緣關(guān)系，健康體檢結(jié)果正常者，均無腫瘤病史、肝炎病史及遺傳病史。其中男性50名，女性30名，平均年齡（45.90±18.38）歲：飲酒（≥100 g/d）25名，不飲酒（＜100 g/d）55名；吸煙（≥10支/d）30名，不吸煙（＜10支/d）50名。抽取肝癌家系非肝癌組及對(duì)照組成員晨起空腹靜脈血液5 mL。本研究按國(guó)家人類基因組研究倫理學(xué)準(zhǔn)則進(jìn)行，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1．2.1 主要試劑及儀器 血液、組織基因組DNA提取試劑盒（含離心柱型）購(gòu)于北京天根生物公司；單堿基延伸引物、PCR擴(kuò)增引物由深圳華大基因公司合成；PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；MassARRAY Analyzer Compact質(zhì)譜系統(tǒng)等購(gòu)自美國(guó)Sequenom公司。

1.2.2 SNP功能位點(diǎn)篩選 利用國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）下載GHR基因的所有SNPs基因分型數(shù)據(jù)。經(jīng)SNPs功能預(yù)測(cè)網(wǎng)站挑選GHR基因功能位點(diǎn)rs6451620作為本研究的靶向位點(diǎn)。

1.2.3 SNP分型 依據(jù)引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)譜峰的位置確定其分子質(zhì)量。1種顏色可對(duì)應(yīng)2個(gè)或3個(gè)峰值，1個(gè)等位基因峰表示該點(diǎn)位純合子，2個(gè)等位基因峰表示該位點(diǎn)雜合子。

1.2.4 樣本DNA提取 采用血液/組織DNA提取試劑盒，對(duì)25例手術(shù)切除肝癌組織樣本、81名肝癌患者直系親屬及80名對(duì)照家系人群靜脈血樣本提取DNA，經(jīng)分光光度計(jì)定量，DNA純度合格標(biāo)準(zhǔn)為OD值為1.7～2.1，將質(zhì)檢合格的DNA樣本置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 GHR基因檢測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)及合成引物設(shè)計(jì) 采用美國(guó)Sequenom公司AssayDesigner3.1software設(shè)計(jì)引物，每個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)1條延伸引物和2條PCR擴(kuò)增引物。PCR上游引物5'-ACGTTGGATGGTATGCCTTAAGATTGGGTG-3'，下游引物5'-ACGTTGGATGCCTCTTTCACTTAGAAACAG-3'，延伸引物 5'-gTTACCAGAGAAGCAGTT-3'，引物均由深圳華大基因公司合成。

1.3.2DNA樣本SNP的基因分型 PCR擴(kuò)增DNA樣本目的基因并純化，采用美國(guó)Sequenom公司的MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以χ2檢驗(yàn)比較兩組性別、年齡、基因型和等位基因分布頻率的差異。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)進(jìn)行樣本基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。非條件logistic回歸法計(jì)算比值比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測(cè)結(jié)果

186例DNA樣本基因分型檢測(cè)結(jié)果顯示，GHR基因rs6451620位點(diǎn)存在AA、GA、GG 3種基因型（圖1），其中AA基因型22例，GA基因型85例，GG基因型79例。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)GHR基因型rs6451620位點(diǎn)的基因型頻率，結(jié)果顯示，基因型頻率期望值與觀察值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），GHR基因rs6451620位點(diǎn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有人群代表性，見表1。

圖1 GHR基因型rs6451620位點(diǎn)SNP基因分型

表1 GHR基因rs6451620位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

2．3 GHR基因rs6451620位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西肝癌家系遺傳易性的關(guān)系

GHR基因rs6451620位點(diǎn)等位基因G和A在肝癌家系肝癌組中分布頻率分別為64%和36%，肝癌家系非肝癌組為60.5%和39.5%，對(duì)照組為70.6%和29.4%。采用非條件logistic回歸校正性別、年齡、吸煙、飲酒等條件后，以肝癌家系肝癌組和非肝癌組人群為研究對(duì)象時(shí)，攜帶A等位基因型的個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因型個(gè)體的0.81倍（95%CI：0.27～2.41，P=0.699），攜帶AA基因型的個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶GG基因型個(gè)體的 0.63倍（95%CI：0.14～2.87，P=0.547）。以肝癌家系肝癌組和健康對(duì)照人群為研究對(duì)象時(shí)，攜帶A等位基因型個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因型個(gè)體的 1.49 倍（95%CI：0.73～3.04，P=0.274），攜帶基因型AA的個(gè)體發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型個(gè)體的 0.91 倍（95%CI：0.32～2.62，P=0.860）。見表2。

表2 GHR基因rs6451620位點(diǎn)基因型及等位基因與廣西肝癌家系遺傳易感性的關(guān)系

3 討論

惡性腫瘤發(fā)病是多因素、多階段的過程，研究顯示在相同外界環(huán)境下，僅小部分個(gè)體罹患肝癌，提示個(gè)體間存在某種差異，可能在肝癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PLXNC1基因rs2272335位點(diǎn)等位基因C、ITGβ1基因rs2298141位點(diǎn)等與原發(fā)性肝癌發(fā)病有關(guān)［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)肺癌、肝癌、乳腺癌等患者中均有GHR表達(dá)，且與腫瘤瘤體大小、分化程度及臨床分期密切相關(guān)［12］。GHR表達(dá)亦與結(jié)腸癌［13］、甲狀腺癌［14］等惡性腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)?；谏鲜鲅芯勘尘?，且目前尚未有GHR基因rs6451620位點(diǎn)與肝癌的相關(guān)報(bào)道，本研究通過查找HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)并利用SNPs功能預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析和預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)GHR基因rs6451620位點(diǎn)可能與肝癌遺傳易感性相關(guān)，將其作為本研究的靶基因位點(diǎn)。

肝癌分布具有地域性，廣西扶綏縣是肝癌高發(fā)地區(qū)，本研究選取長(zhǎng)期生活在廣西扶綏縣的25個(gè)肝癌家系和17個(gè)健康對(duì)照家系人群，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)基因型頻率符合遺傳平衡，提示研究對(duì)象具有人群代表性。進(jìn)一步觀察人群中GHR基因rs6451620位點(diǎn)多態(tài)性，當(dāng)以肝癌家系肝癌和非肝癌人群為研究對(duì)象時(shí)，攜帶A等位基因的個(gè)體罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因個(gè)體的0.81倍，攜帶AA基因型的個(gè)體罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶GG基因型個(gè)體的0.63倍，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以肝癌家系肝癌和健康對(duì)照人群為研究對(duì)象時(shí)，攜帶A等位基因的個(gè)體罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因個(gè)體的1.49倍，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢奊、A等位基因及AA、GA、GG 3個(gè)基因型在肝癌家系非肝癌組和對(duì)照組人群中的分布沒有明顯差異，提示GHR基因rs6451620位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能與廣西扶綏縣肝癌遺傳易感性無明顯相關(guān)性。但本研究選取的樣本均來自我國(guó)肝癌高發(fā)地區(qū)廣西扶綏縣的家系人群，種群差異性小、地域局限，且樣本量較少，可能導(dǎo)致病例選擇偏倚，有關(guān)結(jié)論仍需進(jìn)一步研究。

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