陸梅燕 黃再銘 陽志軍

腫瘤特異性免疫治療是根據(jù)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）可特異性識別存在于腫瘤細(xì)胞表面的抗原多肽，從而特異殺傷腫瘤細(xì)胞［1］。T細(xì)胞識別的抗原是靶細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的MHC-Ⅰ類或Ⅱ類分子呈遞的多肽，因此對腫瘤相關(guān)抗原的CTL表位肽進(jìn)行預(yù)測并制備相應(yīng)的多肽疫苗具有重要意義。相關(guān)抗原肽的CTL表位可被人類白細(xì)胞抗原 A2 （human leukocyte antigen A2，HLA-A2）、HLAA3分子遞呈，而HLA-A2在我國人群中最為常見，陽性率高達(dá)53%［2］，因此篩選HLA-A2限制性CTL表位肽更具代表性。

四跨膜蛋白超家族成員1（transmembrane 4 L6 family member 1，TM4SF1）在多種惡性腫瘤［3-6］組織中高表達(dá)。本課題組前期研究從卵巢癌腹水腫瘤細(xì)胞構(gòu)建的cDNA文庫中篩選出相關(guān)抗原TM4SF1，發(fā)現(xiàn)其可能與卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)［7-8］。TM4SF1有免疫治療靶點(diǎn)的潛能，來源于TM4SF1的HLA-A2限制性多肽可能通過激活CTL，殺滅表達(dá)TM4SF1的卵巢癌細(xì)胞，從而抑制腫瘤生長。本研究聯(lián)合目前國際上常用的量化基序法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測法、基于蛋白三維結(jié)構(gòu)和超基序法［9-11］對卵巢癌相關(guān)抗原TM4SF1 HLA-A2限制性的CTL表位進(jìn)行預(yù)測，并利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzyme-linked immunospot assy，ELISPOT）對候選表位肽的免疫反應(yīng)性進(jìn)行檢測，為TM4SF1作為免疫治療靶點(diǎn)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 TM4SF1氨基酸序列

在PubMed Protein數(shù)據(jù)庫檢索TM4SF1氨基酸序列（NCBI Reference Sequence：NP_055035.1），具體序列見表1。

表1 TM4SF1氨基酸序列

1.2 主要試劑及儀器

SPF級HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，雌性，4～6周齡，體重18～23 g，引種自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院［編號及品系：J003475 C57BL/6-Tg（HLA-A2.1）1Enge/JNju，引自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室］。Mouse IFN-γprecoated ELISPOT Kit購自深圳達(dá)科為有限公司，AF Human IL-2購自美國Peprotech公司，不完全弗氏佐劑IFA購自美國Sigma公司，小鼠脾臟組織淋巴細(xì)胞分離液試劑盒、ImmunoSpot S5酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像分析儀購自美國CTL公司。

1.3 表位肽的預(yù)測

本研究所需的表位多肽（P1～P10）、陽性對照肽［P（+），具體序列：YMLDLQPETT，從 HPV 的 E7蛋白鑒定為HLA-A2特異性的CTL表位］、陰性對照肽［P（-），具體序列：LYLTQDLFL，從SARS冠狀病毒刺突蛋白鑒定的非HLA-A2特異CTL表位的多肽序列］均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司合成。選用基于量化基序法的BIMAS軟件（http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）、基于超基序法的 SYFPEITHI軟件（http：//www.syfpeithi.de/）、基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測法的IEDB軟件（http：//tools.immuneepitope.org/mhci/）、基于蛋白三維結(jié)構(gòu)的軟件PROPRED I（http：//www.imtech.res.in/raghava/propred1/）等4種在線預(yù)測軟件。BIMAS預(yù)測軟件主要基于量化基序法的基本原理，以MHC-肽結(jié)合物解離的生物半衰期反映MHC-I類分子與肽的親和力［12］，裂解半衰期越長，評分越高。SYFPEITHI軟件根據(jù)抗原肽的長度、殘基組成的特征、基于HLA結(jié)合肽的錨定氨基酸性質(zhì)進(jìn)行匹配，有效進(jìn)行預(yù)測，這是超基序法；PROPRED I提供47種MHC-I類分子基序信息，并提供蛋白酶體和免疫蛋白酶體切割點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。通常認(rèn)為C-末端具有蛋白酶體切割位點(diǎn)的肽具有CTL表位潛能，以上軟件均選擇評分高的多肽進(jìn)入候選。IEDB軟件采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測輸出IC50nM單位，IC50被定義為待測肽將對照肽-MHC復(fù)合物中50%的對照肽置換下來的濃度。較低的數(shù)字說明親和力更高，肽IC50＜50 nM被認(rèn)為是高親和力，選擇評分低的結(jié)果進(jìn)行分析。根據(jù)Panagiotopoulos等［13］報道的方法，聯(lián)合多個軟件預(yù)測HLA-A 2.1限制性表位，按所得積分相乘進(jìn)行加權(quán)，因IEDB軟件選擇評分低的結(jié)果進(jìn)行分析，分?jǐn)?shù)越低表明親和力越高，故可根據(jù)公式（總評分=BIMAS分值×SYFPEITHI分值×PROPREDI分值÷IEDB分值）計算分值，根據(jù)分值選擇排在前10位的多肽。

1.4 多肽免疫HLA-A 2.1轉(zhuǎn)基因小鼠

根據(jù)參考文獻(xiàn)［14］對HLA-A 2.1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行多肽免疫。轉(zhuǎn)基因小鼠21只，隨機(jī)分為7組，每組3只：⑴陽性肽對照組；⑵陰性肽對照組；⑶多肽P1組；⑷多肽P2組；⑸多肽P8組；⑹多肽P10組；⑺佐劑PBS IFA對照組。0.5 mL IFA與0.5 mL PBS（含1 mg多肽）按1∶1體積制備成1 mL“油包水”乳狀液，按100 μL/只分別于第1天、第8天注射于小鼠左側(cè)腹股溝皮下。

1.5 ELISPOT檢測免疫后小鼠脾臟淋巴結(jié)細(xì)胞中IFN-γ的分泌水平

末次免疫7 d后頸椎脫臼法處死小鼠，無菌下取小鼠脾臟組織制備單細(xì)胞懸液。每只小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞分成2組，一組用于直接法ELISPOT檢測；另一組用于預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT檢測。ELISPOT陽性刺激劑：佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）+離子霉素（Ionomycin）標(biāo)準(zhǔn)品粉末（含于 Mouse IFN-γ precoated ELISPOT Kit試劑盒中）作為ELISPOT系統(tǒng)陽性對照，以500 μ PBS重懸，濃度為PMA 500 ng/mL+Ionomycin 10 μg/mL，混勻后使用。以每孔 100 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液加入10 μL工作液，作用于105個小鼠脾臟淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生明顯的陽性斑點(diǎn)。用10%完全培養(yǎng)基（含終濃度為10 μg/mL的多肽、10 U/mL的重組IL-2）將細(xì)胞調(diào)成濃度為 1×106/mL，1 mL/well種于24孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后行ELISPOT檢測。具體步驟如下：⑴預(yù)包被板的活化：用小鼠IFN-γ單克隆抗體包被的96孔板，每孔加入200 μL無血清培養(yǎng)基，室溫靜置5～10 min后將培養(yǎng)基扣出；⑵細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，濃度 1×106/mL，100 μL/well，刺激物10 μL/well，加入各孔，每組3個復(fù)孔。設(shè)正對照孔、負(fù)對照孔、實(shí)驗(yàn)孔、背景對照孔，具體設(shè)計如表2。⑶ELISPOT板靜置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16～20 h；⑷裂解細(xì)胞、抗體孵育、酶聯(lián)親和素孵育、顯色、終止顯色、ELISPOT板斑點(diǎn)計數(shù)按試劑盒操作手冊進(jìn)行。

表2 ELISPOT實(shí)驗(yàn)分組

1.6 ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)

ELISPOT結(jié)果質(zhì)量控制：ELISPOT檢測產(chǎn)生的斑點(diǎn)是抗原特異性IFN-γ分泌的CTL頻數(shù)，即斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spot forming cell，SFC）。以平行陽性刺激對照作為ELISPOT質(zhì)量控制的指標(biāo)。ELISPOT結(jié)果判定：ELISPOT檢測結(jié)果中，斑點(diǎn)數(shù)量代表分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量，反映多肽刺激活化CTL的能力。一個斑點(diǎn)代表一個CTL，根據(jù)分布非均勻性重采樣方法（distributionfree resampling，DFR），陽性 SFC的凈值（C）（E）代表抗原肽刺激的實(shí)驗(yàn)孔產(chǎn)生的SFC的平均數(shù)量（C）代表自身陰性對照SFC的平均數(shù)量。ELISPOT的平均斑點(diǎn)大小代表多肽刺激下單個細(xì)胞分泌INF-γ因子的水平。每個孔的斑點(diǎn)數(shù)及每個孔的平均斑點(diǎn)大小由ImmunoSpot S5酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像分析儀分析獲得。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism（Ver5，GraphPad Software）作圖。

2 結(jié)果

2.1 4種軟件預(yù)測HLA-A 2.1限制性表位的結(jié)果

通過多種軟件預(yù)測，最后根據(jù)Panagiotopoulos等［13］報道的方法綜合計算總分值，選擇分值排名前10的多肽（命名為P1～P10），見表3。

表3 4種軟件預(yù)測HLA-A 2.1限制性表位的結(jié)果

2.2 ELISPOT檢測多肽免疫HLA-A 2.1轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生特異T細(xì)胞反應(yīng)

2.2.1 多肽免疫HLA-A 2.1轉(zhuǎn)基因小鼠后的一般狀況 各組小鼠免疫前體重、飲食及活動度等無明顯差異。免疫后各組小鼠體重、進(jìn)食量、進(jìn)水量及活動度改變均無明顯差異，無小鼠死亡。

2.2.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞提取及體外刺激培養(yǎng) 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞采用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，細(xì)胞計數(shù)達(dá)（5±2）×106細(xì)胞/鼠。經(jīng)多肽及IL-2 體外刺激 48 h后，細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞聚團(tuán)，個別細(xì)胞形態(tài)增大，見圖1。

圖1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞（×200）

2.2.3 ELISPOT檢測免疫后IFN-γ的分泌水平 實(shí)驗(yàn)所用PMA陽性刺激頻率平均約為104/106PBMC細(xì)胞（1%），各組正對照孔出現(xiàn)的平均SFC均達(dá)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中陰性肽對照組、多肽P2組、多肽P8組及佐劑對照組均未達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)的SFC出現(xiàn)（表4）。出現(xiàn)（E）的多肽為陽性對照肽、P1和P10，直接法ELISPOT中，自身陰性對照肽不出現(xiàn)斑點(diǎn)（C）；而預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT檢測時（體外IL-2和相應(yīng)多肽刺激后檢測），不僅平均（E）增加，且自身陰性對照肽出現(xiàn)斑點(diǎn)（C），見圖 2。

圖2 預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT ImmunoSpot S5酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像分析儀成像示意圖

表4 ELISPOT檢測中PMA刺激產(chǎn)生的SFC數(shù)目（±s）

表4 ELISPOT檢測中PMA刺激產(chǎn)生的SFC數(shù)目（±s）

SFC數(shù)目預(yù)培養(yǎng)法 直接培養(yǎng)法陽性肽對照組（P+） 1179±125 1205±179陰性肽對照組（P-） 1008±83 1076±89佐劑對照組 1047±174 1051±137多肽 P1 組 1157±101 1094±77多肽 P2 組 1127±177 1064±172多肽 P8 組 1253±100 1166±211多肽 P10 組 1033±90 1166±116組別

2.2.4 直接法ELISPOT與預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT檢測結(jié)果 ⑴多肽活化CTL能力的比較：多肽預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT產(chǎn)生SFC的凈值T明顯高于直接法ELISPOT［（陽性肽對照組：322±8 vs 169±22，P＜0.001）、（多肽 P1：114±10 vs 39±7，P＜0.001）、（多肽 P10：156±31 vs 52±8，P＝0.002）］，見表5、圖 3。⑵單個活化 CTL 細(xì)胞分泌INF-γ能力的比較：比較各組斑點(diǎn)的平均大小發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT產(chǎn)生斑點(diǎn)的平均大小明顯大于直接法ELISPOT［（陽性肽對照組21.91±2.45 vs 13.8±1.76，P＜0.05）、（多肽 P1：12.9±088 vs 8.31±140，P＜0.05）、（多肽 P10：17.5±3.85 vs 11.96±0.61，P＜0.05）］，預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT活化CTL單個細(xì)胞分泌INF-γ水平更高，見圖4。⑶候選多肽的免疫反應(yīng)性鑒定：P1和P10均產(chǎn)生SFC，以預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，多肽P10活化細(xì)胞的能力高于多肽P1（156±31 vs 114±10，P＜0.05）。兩種多肽刺激下單細(xì)胞分泌 INF-γ水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（17.50±3.85 vs 12.90±0.88，P＞0.05）。

圖3 直接法ELISPOT和預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT檢測中多肽刺激產(chǎn)生的SFC凈值T

圖4 直接法ELISPOT和預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT檢測的平均斑點(diǎn)大小

表5 直接法ELISPOT與預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT檢測中多肽刺激產(chǎn)生的SFC凈值T（±s）

表5 直接法ELISPOT與預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT檢測中多肽刺激產(chǎn)生的SFC凈值T（±s）

（E）：抗原肽刺激實(shí)驗(yàn)孔產(chǎn)生的SFC的平均數(shù)量；（C）：自身陰性對照孔SFC平均數(shù)量；T=（E）-（C）

預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT 直接法ELISPOT組別P（C） T陽性肽對照組 378±19 53±7 322±8 169±22 0 169±22 ＜0.001多肽P1組 179±4 64±10 114±10 39±7 0 39±7 ＜0.001多肽 P10 組 208±77 26±6 156±31 52±8 0 52±8 0.002（E）（C） T （E）

3 討論

腫瘤治療性肽疫苗的設(shè)計和制備是目前腫瘤免疫治療中常用的技術(shù)，其中腫瘤抗原中CTL表位肽的特異性在所有腫瘤治療性疫苗中最強(qiáng)，此類肽主要依賴于CTL以主動免疫的方式誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)，并引發(fā)長期存活記憶性T細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤或預(yù)防復(fù)發(fā)的目的。MHC-Ⅰ類分子與抗原肽的親和力及穩(wěn)定結(jié)合是CTL免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，也是表位鑒定的前提。隨著越來越多的計算方法和數(shù)據(jù)庫的開發(fā)與建立，預(yù)測多肽序列與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合得以解決，降低了實(shí)驗(yàn)成本且提高時效。為避免單一軟件預(yù)測的局限性，本研究選用BIMAS、SYFPEITHI、IEDB、PROPRED I 4種軟件進(jìn)行預(yù)測分析，且因各種軟件均有其優(yōu)點(diǎn)與局限性，為提高預(yù)測效果，對每種預(yù)測軟件前10位的多肽進(jìn)行綜合分析，選取綜合預(yù)測分值較高的肽序列，結(jié)果提高了預(yù)測潛效能。

TM4SF1在以往的腫瘤免疫治療研究中被作為以抗體為基礎(chǔ)的免疫治療靶點(diǎn)，但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)以抗TM4SF1的L6單克隆抗體治療腫瘤效果有限［14］，可能原因?yàn)榭贵w的半衰期短或抗體在體內(nèi)的靶向效率低，更重要的是以抗體為基礎(chǔ)的免疫治療無法誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞參與，限制了抗體治療的效果。在腫瘤的生物免疫治療中，除抗體治療外，制備肽疫苗并誘導(dǎo)CTL特異滅殺腫瘤細(xì)胞是目前較具價值的生物免疫治療研究方向。Tu等［15］首次報道TM4SF1基于CTL在乳腺癌的基礎(chǔ)研究，預(yù)測出可能的CTL表位，將篩選后的表位肽免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)可激發(fā)CTL免疫應(yīng)答，有效抑制TM4SF1相關(guān)腫瘤細(xì)胞生長。本研究綜合分析了上述4種預(yù)測方法結(jié)果，最終篩選出10條多肽（P1～P10）作為卵巢癌相關(guān)抗原TM4SF1候選CTL表位肽。通過免疫信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測模型所得的候選表位肽，理論上認(rèn)為可被抗原遞呈細(xì)胞穩(wěn)定遞呈。然而預(yù)測出的CTL表位肽與體內(nèi)的CTL表位是否一致，以及其在動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

多肽類疫苗成功的關(guān)鍵是篩選出對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答的CTL表位［16］。但并非所有具備高親和力的表位肽都能有效激發(fā)特異性CTL。目前部分學(xué)者在篩選多肽表位時并非以最高親和力為標(biāo)準(zhǔn)，而傾向于低親和力的表位肽。還有研究顯示，當(dāng)用某種低親和力的表位激發(fā)CTL應(yīng)答，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡裂解，同時可能產(chǎn)生另一些隱蔽的腫瘤相關(guān)抗原肽，這種抗原肽被抗原遞呈細(xì)胞處理后，又可激發(fā)針對新表位的CTL，從而識別殺傷腫瘤細(xì)胞［17］。因此，檢測表位肽特異性CTL反應(yīng)是確定表位的重要步驟。檢測免疫反應(yīng)的方法包括經(jīng)典的T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、MHC四聚體法、ELISPOT和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法等。其中，ELISPOT可反映抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞因子IFN-γ的分泌量，靈敏度較ELISA高102～103倍，可精確單個活化細(xì)胞的分泌因子，被廣泛應(yīng)用于機(jī)體細(xì)胞免疫功能檢測，是目前抗原肽動物模型體內(nèi)免疫原性鑒定常用的方法［18-19］。

本研究將4條候選表位多肽聯(lián)合佐劑免疫HLAA2.1轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)ELISPOT法檢測多肽特異T細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果顯示，預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT比直接法ELISPOT可產(chǎn)生更多、更大、更明顯的斑點(diǎn)，說明預(yù)培養(yǎng)法通過體外加入表位肽和IL-2預(yù)刺激，可加強(qiáng)T細(xì)胞增殖活化，從而提高ELISPOT檢測的敏感度，與Le Campion等［20］研究結(jié)果一致。可能由于IL-2不僅能促進(jìn)T細(xì)胞分裂，還能增強(qiáng)其殺傷活性，是體外T細(xì)胞培養(yǎng)必不可少的細(xì)胞因子。且T細(xì)胞只在被抗原刺激時，才能表達(dá)IL-2受體，使其與IL-2結(jié)合，并通過啟動JAK-STAT、MAPK及PI3K等多種生物途徑，誘導(dǎo)T細(xì)胞生長，促進(jìn)活化。本研究ELISPOT檢測結(jié)果顯示只有多肽P1和P10免疫的小鼠體內(nèi)有CTL激活，其中P10的活化細(xì)胞頻數(shù)高于P1，而兩者單細(xì)胞平均INF-γ分泌水平無差異，提示多肽P10的免疫原性較P1更高。但P10、P1多肽能否誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性CTL免疫殺傷效應(yīng)，以及其在實(shí)體瘤中的作用仍需進(jìn)一步研究。

本研究顯示，聯(lián)合多種預(yù)測軟件可有效避免單一軟件的局限，獲得較理想的候選表位。預(yù)培養(yǎng)法ELISPOT較直接法ELISPOT靈敏性更高，多種軟件聯(lián)合ELISPOT預(yù)培養(yǎng)法可有效篩選出免疫反應(yīng)性更強(qiáng)的卵巢癌相關(guān)抗原優(yōu)勢HLA-A2限制性CTL表位肽，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

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