劉進生 黃良祥 李建黨 吳健生 夏浩沄

miRNAs可能參與細胞發(fā)育、增殖、分化及腫瘤發(fā)生等多種生理病理過程［1-3］，被認(rèn)為是結(jié)腸癌耐藥的重要調(diào)節(jié)分子［4］。核因子NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）蛋白是一種亮氨酸拉鏈（leucine zipper，bZIP）蛋白，其高表達與腫瘤細胞耐藥性有密切聯(lián)系［5-8］。前期工作中，我們采用miRNA靶標(biāo)預(yù)測數(shù)據(jù)庫等預(yù)測并篩選以Nrf2為靶標(biāo)的miRNA，認(rèn)為miR-140-5p極可能靶向Nrf2而發(fā)揮其生物學(xué)功能。miR-140p-5p被報道與非小細胞肺癌、食管鱗癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-10］。本研究探討miR-140-5p在結(jié)腸癌細胞5-FU耐藥中的調(diào)控作用及Nrf2基因參與此過程的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細胞株SW480購于中國科學(xué)院上海細胞庫。5-FU購于美國Sigmal公司；miR-140-5p的mimic、INH及其分別對照vector、NC均購于廣州市銳博生物科技有限公司；兔抗Nrf2多克隆抗體、鼠抗β-actin多克隆抗體、二抗羊抗兔IgG、二抗兔抗鼠IgG購于美國Cell Signaling Technology公司；雙熒光素酶報告分析試劑盒購于美國Promega公司。倒置顯微鏡系統(tǒng)購于德國Leica公司；7500Fast實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司；化學(xué)發(fā)光顯影儀購于美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與結(jié)腸癌SW480/5-FU耐藥細胞模型的構(gòu)建 SW480/5-FU、SW480細胞培養(yǎng)于含10%FBS RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。待細胞長至對數(shù)增長期，0.25%胰酶消化，重懸計數(shù)細胞，以0.8×105/mL細胞密度接種于96孔板中，待細胞長至匯合度為30%～40%時予不同濃度（1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、500 μmol/L、5 000 μmol/L、10 000 μmol/L）5-FU 干預(yù) 48 h，每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測吸光度值。GraphPad軟件計算IC50，并計算耐藥指數(shù)（resistance index，RI），RI=IC50（SW480/SW480-5-FU）/IC50（SW480）。SW480/5-FU耐藥細胞模型的構(gòu)建方法參考文獻［11］。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 將WT-Nrf2-3'UTR片段和Mut-Nrf2-3'UTR片段克隆至熒光素酶報告載體（pGL4.22-luc2CP/Puro），合成WT-Nrf2-3'UTR熒光素酶報告質(zhì)粒和Mut-Nrf2-3'UTR熒光素酶報告質(zhì)粒。將WT-Nrf2片段和Mut-Nrf2片段克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒，構(gòu)建WT-Nrf2質(zhì)粒和Mut-Nrf2質(zhì)粒。上述質(zhì)粒均通過一代測序驗證后進行大抽，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 SW480/5-FU、SW480細胞以4×105/mL細胞密度接種到6孔板，待細胞長至匯合度達70%～80%時轉(zhuǎn)染。CCK-8、細胞集落形成實驗檢測細胞5-FU耐藥性實驗和qRT-PCR、Westernblot中，將SW480/5-FU細胞分為2組，分別轉(zhuǎn)染25 pmol miR-140-5p mimic（mimic）和 25 pmol mimic 的模擬物 miR-140-5p vector（vector）；將SW480細胞分為2組，分別轉(zhuǎn)染25 pmol miR-140-5p inhibitor（INH）和 25 pmol INH 的模擬物miR-140-5p NC（NC）。在熒光素酶報告基因檢測實驗中，將SW480/5-FU細胞分為4組，分別轉(zhuǎn)染25pmol mimic+20 ng WT-Nrf2-3'UTR質(zhì)粒、25 pmol vector+20 ng WT-Nrf2-3'UTR質(zhì)粒、25 pmol mimic+20 ng Mut-Nrf2-3'UTR質(zhì)粒、25 pmol vector+20 ng Mut-Nrf2-3'UTR質(zhì)粒；將SW480細胞分為4組，分別轉(zhuǎn)染25 pmol INH+20 ng WT-Nrf2-3'UTR質(zhì)粒、25 pmol NC+20 ng WT-Nrf-3'UTR質(zhì)粒、25 pmol INH+20 ng Mut-Nrf2-3'UTR質(zhì)粒、25 pmol NC+20 ng Mut-Nrf2-3'UTR質(zhì)粒；以表達海腎熒光素酶的質(zhì)粒作為內(nèi)參照，轉(zhuǎn)染48 h后檢測。CCK-8和細胞集落形成實驗檢測Nrf2對miR-140-5p調(diào)控SW480/5-FU細胞5-FU敏感性實驗中，將SW480/5-FU細胞分為4組，分別轉(zhuǎn)染25 pmol mimic+20 ng WT-Nrf2質(zhì)粒、25 pmol vector+20 ng WTNrf2質(zhì)粒、25 pmol mimic+20 ng Mut-Nrf2質(zhì)粒、25 pmol vector+20 ng Mut-Nrf2質(zhì)粒；將SW480細胞分為4組，分別轉(zhuǎn)染25 pmol INH+20 ng WT-Nrf2質(zhì)粒、25 pmol NC+20 ng WT-Nrf2質(zhì)粒、25 pmol INH+20 ng Mut-Nrf2質(zhì)粒、25 pmol NC+20 ng Mut-Nrf2質(zhì)粒；以表達海腎熒光素酶的質(zhì)粒作為內(nèi)參照。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力 細胞接種于96孔板干預(yù)后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度值，并計算各組細胞活力。

1.2.5 細胞集落形成實驗 將上述干預(yù)后的細胞消化，按照500個細胞/孔重新接種于12孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞長至肉眼看見集落，棄上清液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定細胞20 min，結(jié)晶紫染色液染色15 min，PBS清洗后拍照并觀察集落形成情況。

1.2.6 qRT-PCR法檢測相關(guān)基因的表達水平 將上述干預(yù)后的細胞裂解并抽提miRNA，抽提總RNA，紫外線分光光度儀測定RNA的濃度和純度。miR-140-5p表達檢測參考試劑盒說明說書進行操作，以U6作為內(nèi)參，miR-140-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCATA-3'，上游引物序列：5'-GAGTGTCAGTGGTTTTACCCT-3'，下游引物序列：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；取 2 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，按照每20 μL PCR反應(yīng)體系中含有2 μg cDNA進行PCR反應(yīng)，條件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循環(huán) 40次；72 ℃60 s。Nrf2表達檢測：以GAPDH為內(nèi)參，Nrf2上游引物序列：5'-CTTGGCCTGAGTGATTCTGAAGTG-3'，下游引物序列：5'-CCGAGATGGTGACAAGGGTTGTA-3'；取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)體系同上，條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán) 40 次；72℃ 60 s。收集各孔循環(huán)閾值（Ct值）。所得的結(jié)果按照2-ΔΔCt相對定量法計算目的基因的相對表達量。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，3次實驗取均值。

1.2.7 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達水平 裂解細胞，獲取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取30 μg樣品調(diào)整統(tǒng)一上樣體積。用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，電泳條件：80 V 30 min，120 V 1.5 h；轉(zhuǎn)膜條件：90 V 1.5 h。TBST（含吐溫的Tris-HCL緩沖液）洗滌后5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，再次TBST洗滌；兔抗小鼠Nrf2多克隆抗體（1：1 000）4℃孵育過夜。TBST洗滌后用羊抗兔IgG二抗（1：1 000）室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光顯影液將膜孵勻，熒光成像系統(tǒng)進行化學(xué)發(fā)光成像，保存圖片數(shù)據(jù)。

1.2.8 預(yù)測并篩選可能以Nrf2為靶標(biāo)的miRNA 通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜尋Nrf2轉(zhuǎn)錄本3'UTR序列，采用miRNA靶標(biāo)預(yù)測數(shù)據(jù)庫 TargetScan（http：//www.targetscan.org/）、PicTar（http：//pictar.mdc-berlin.de/cgibin/PicTar_vertebrate.cgi）和 microRNA.org（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）預(yù)測Nrf2 3'UTR可能的miRNA和結(jié)合位點。通過PubMed檢索上述數(shù)據(jù)庫預(yù)測出的有關(guān)miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究，確定本研究感興趣的靶基因。

1.2.9 熒光素酶報告基因檢測 參照說明書操作。裂解細胞20 min，移出10 μL于96孔熒光檢測板內(nèi)，加入35 μL LARII工作液迅速混勻，于多功能酶標(biāo)儀中讀取螢火蟲螢光素酶激發(fā)熒光強度F值；取出檢測板加入35 μL Stop&Glo工作液混勻，讀取海腎螢光素酶激發(fā)熒光強度R值。根據(jù)公式計算相對熒光素酶活性：相對熒光酶活性=F值/R值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組數(shù)據(jù)間比較使用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SW480/5-FU耐藥細胞模型的5-FU耐藥性驗證

細胞的5-FU耐藥性驗證結(jié)果顯示，5-FU能明顯抑制 SW480細胞活力，其 IC50為 45.8 μmol/L；與SW480相比，SW480/5-FU對5-FU的敏感性顯著降低，在100 μmol/L濃度以內(nèi)的5-FU干預(yù)下，SW480/5-FU細胞活力無明顯影響，其IC50為499.3 μmol/L（圖1）。基于上述結(jié)果計算，SW480/5-FU的耐藥指數(shù)為 10.9（RI＞1.5），說明本實驗所構(gòu)建的 SW480/5-FU細胞模型具有較高的耐藥性。

圖1 CCK-8法檢測5-FU對SW480細胞、SW480/5-FU細胞5-FU敏感性的影響

2.2 miR-140-5p在SW480細胞和SW480/5-FU細胞中的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，SW480/5-FU細胞中miR-140-5p表達水平為SW480細胞的0.7倍（P＜0.05）。提示miR-140-5p表達水平可能與結(jié)腸癌5-FU耐藥有關(guān)。

2.3 miR-140-5p調(diào)控SW480/5-FU細胞和SW480細胞對5-FU的敏感性

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-140-5p vector的對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic可降低不同濃度5-FU干預(yù)48 h后SW480/5-FU的細胞活力，并明顯抑制300 μmol/L 5-FU干預(yù)下SW480/5-FU細胞的增殖能力（圖2A）。在SW480細胞中，與轉(zhuǎn)染miR-140-5p NC的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-140-5p INH能增加SW480細胞不同濃度5-FU干預(yù)48 h后的細胞活力（圖2B）。此外，細胞集落實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染miR-140-5p vector的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic能減少SW480/5-FU細胞的集落形成能力（P＜0.05）（圖2C）。

圖2 CCK-8法檢測過表達miR-140-5p對SW480/5-FU細胞、SW480細胞5-FU敏感性的影響

2.4 miR-140-5p可直接結(jié)合并抑制Nrf2表達

通過對公共數(shù)據(jù)庫進行挖掘，推測miR-140-5p能結(jié)合于Nrf2的3'UTR（WT-3'UTR）第347-354個堿基對，提示Nrf2可能是miR-140-5p的靶基因（圖3A）。實驗結(jié)果表明，在SW480/5-FU細胞中，與轉(zhuǎn)染miR-140-5p vector的對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic能顯著抑制Nrf2的 mRNA及蛋白的表達（P＜0.05，圖3B）；在SW480細胞中，與轉(zhuǎn)染miR-140-5p NC的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-140-5p INH能上調(diào)Nrf2 mRNA及蛋白的表達水平（P＜0.05，圖3C）。進一步將Nrf2的3'UTR與miR-140-5p結(jié)合的位點設(shè)計突變（Mut-3'UTR），使其失去與miR-140-5p結(jié)合的能力（圖3 A），并構(gòu)建了帶有野生型Nrf2 3'UTR的WT-Nrf2-3'UTR熒光素酶報告質(zhì)粒（WT-Nrf-3'UTR質(zhì)粒）和帶有Nrf2 3'UTR突變的Mut-Nrf2-3'UTR熒光素酶報告質(zhì)粒（Mut-Nrf-3'UTR質(zhì)粒），用于熒光素酶報告基因檢測。檢測結(jié)果顯示，在SW480/5-FU細胞中，與共轉(zhuǎn)染miR-140-5p vector的對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic能顯著下調(diào)WT-Nrf2-3'UTR的相對熒光素酶活性（P＜0.05），而對Mut-Nrf2-3'UTR的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05，圖 3D）；在 SW480細胞中，與共轉(zhuǎn)染miR-140-5p NC的對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-140-5p INH能顯著下調(diào)WT-Nrf2-3'UTR的相對熒光素酶活性（P＜0.05），而對Mut-Nrf2-3'UTR的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05，圖3E）。以上結(jié)果共同說明，miR-140-5p可通過與Nrf2的3'UTR結(jié)合，下調(diào)Nrf2表達。

圖3 miR-140-5p與Nrf2的關(guān)系

2.5 Nrf2參與miR-140-5p調(diào)控SW480/5-FU細胞對5-FU的敏感性

與共轉(zhuǎn)染vector和WT-Nrf2相比，SW480/5-FU細胞共轉(zhuǎn)染mimic和WT-Nrf2的細胞增殖能力明顯下降（P＜0.05），提示 miR-140-5p能抑制 Nrf2過表達所導(dǎo)致的SW480/5-FU細胞對5-FU較強的耐藥性（圖4A）。細胞集落形成實驗結(jié)果表明，過表達WT-Nrf2使SW480/5-FU細胞的集落形成能力明顯增強，且能逆轉(zhuǎn)miR-140-5p mimic干預(yù)下SW480-5FU細胞的5-FU敏感性（圖4B）。

圖4 miR-140-5p通過調(diào)控Nrf2影響SW480/5-FU細胞的5-FU敏感性

3 討論

耐藥一直是結(jié)直腸癌臨床治療面臨的棘手問題，從miRNAs中尋求其耐藥靶點成為目前結(jié)直腸癌耐藥性研究的熱點。我們前期研究通過公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘，推測miR-140-5p可能與腫瘤耐藥性相關(guān)基因Nrf2結(jié)合，可能參與腫瘤耐藥調(diào)控機制。為進一步探究miR-140-5p在結(jié)腸癌耐藥研究中的潛在價值，本研究通過構(gòu)建人結(jié)腸癌細胞株SW480的5-FU穩(wěn)定耐藥細胞株SW480/5-FU，并驗證了miR-140-5p在耐藥細胞SW480/5-FU中高表達，提示miR-140-5p可能參與調(diào)控結(jié)腸癌5-FU耐藥。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-140-5p能顯著增加耐藥細胞株SW480/5-FU對5-FU的敏感性，提示miR-140-5p可能在抑制細胞對5-FU的耐藥中有重要作用。

miR-140-5p已被證實與結(jié)直腸癌生長、侵襲及預(yù)后有關(guān)［12-14］。以往研究更多將Nrf2視為細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中的關(guān)鍵因子，可通過調(diào)控抗氧化相關(guān)蛋白，抑制損傷和炎癥中氧化應(yīng)激損傷發(fā)生［15］。近年研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因激活可能促進新的癌變發(fā)生，且Nrf2能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境調(diào)控腫瘤對化療藥物的耐藥性［5-6，15］。因此，抑制腫瘤細胞中 Nrf2的表達是克服腫瘤細胞耐藥的重要策略。為進一步分析miR-140-5p對結(jié)腸癌細胞5-FU耐藥性的調(diào)控是否與其結(jié)合Nrf2的互作作用有關(guān)，本研究首先通過雙熒光素酶報告基因和Western blot實驗進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-140-5p可與Nrf2結(jié)合，并抑制耐藥基因Nrf2表達；進一步探究miR-140-5p調(diào)控結(jié)腸癌細胞耐藥性與miR-140-5p結(jié)合并抑制Nrf2之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Nrf2可影響miR-140-5p對SW480/5-FU細胞的5-FU敏感性，即miR-140-5p能通過調(diào)控Nrf2表達影響SW480/5-FU細胞對5-FU的敏感性，進一步研究miR-140-5p靶向抑制Nrf2功能而在結(jié)腸癌細胞耐藥性中的作用提供依據(jù)，有關(guān)方面值得深入探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-140-5p可通過靶向抑制Nrf2表達而降低結(jié)腸癌細胞對5-FU的耐藥性，為防治結(jié)直腸癌耐藥提供了新方向，miR-140-5p有望成為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌耐藥的靶點。

［1］ Li ZH，Rana TM.Therapeutic targeting of microRNAs：current status and futurechallenges［J］.Nat RevDrugDiscov，2014，13（8）：622-638.

［2］ Rupaimoole R，Slack FJ.MicroRNA therapeutics：towards a new era for the management of cancer and other diseases［J］.Nat Rev Drug Discov，2017，16（3）：203-222.

［3］ van Beijnum JR，Giovannetti E，Poel D，et al.miRNAs：micro-managers of anticancer combination therapies［J］.Angiogenesis，2017.

［4］ 謝學(xué)成，邱海，覃宇周.microRNAs與結(jié)直腸癌［J］.中國癌癥防治雜志，2014，6（3）：310-314.

［5］ Jeddi F，Soozangar N，Sadeghi MR，et al.Contradictory roles of Nrf2/Keap1 signaling pathway in cancer prevention/promotion and chemoresistance［J］.DNA Repair（Amst），2017，54：13-21.

［6］ Penning TM.Aldo-Keto reductase regulation by the Nrf2 system：implications for stress response，chemotherapy drug resistance，and carcinogenesis［J］.Chem Res Toxicol，2017，30（1）：162-176.

［7］ Ryoo IG，Lee SH，Kwak MK.Redox modulating NRF2：a potential mediator of cancer stem cell resistance［J］.Oxid Med Cell Longev，2016：2428153.

［8］ Samatiwat P，Prawan A，Senggunprai L，et al.Nrf2 inhibition sensitizes cholangiocarcinoma cells to cytotoxic and antiproliferative activities of chemotherapeutic agents［J］.Tumour Biol，2016，37（8）：11495-11507.

［9］ Flamini Valentina，Jiang Wen G，Cui Yuxin.Therapeutic Role of MiR-140-5p for the treatment of non-small cell Lung cancer［J］.Anticancer Res，2017，37（8）：4319-4327.

［10］ Zhao Ke，Chen Bao-Jun，Chen Zhi-Guo.ErbB4 as a potential molecular target in the treatment of esophageal squamous cell cancers［J］.Scientific World Journal，2014，124105.

［11］胡萬樂，何占紅，蔣芳，等.5-Fu誘導(dǎo)人大腸癌SW480細胞株耐藥與自噬活性的變化［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2013，19（3）：279-282.

［12］ Mosakhani N，Lahti L，Borze I，et al.MicroRNA profiling predicts survival in anti-EGFR treated chemorefractory metastatic colorectal cancer patients with wild-type KRAS and BRAF［J］.Cancer Genet，2012，205（11）：545-551.

［13］ Zhai H，F(xiàn)esler A，Ba Y，et al.Inhibition of colorectal cancer stem cell survival and invasive potential by hsa-miR-140-5p mediated suppression of Smad2 and autophagy［J］.Oncotarge，2015，6（23）：19735-19746.

［14］ Zhang W，Zou C，Pan L，et al.MicroRNA-140-5p inhibits the progression of colorectal cancer by targeting VEGFA［J］.Cell Physiol Biochem，2015，37（3）：1123-1133.

［15］ DeNicola GM，Karreth FA，Humpton TJ，et al.Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes ROS detoxification and tumorigenesis［J］.Nature，2011，475（7354）：106-109.