郇雪潔 姬逸男 楊寧 伍越 朱玲鈺 楊華偉

核糖體S6蛋白激酶4（ribosomal protein S6 kinase 4，RSK4）位于X染色體q21區(qū)域，是一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶［1］。研究表明，RSK4基因是抑癌基因，能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移［2-3］。本課題組前期研究表明RSK4相關(guān)表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞體外侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，且在MDA-MB-231細(xì)胞系中表達(dá)最低［4］?？勺兗艚邮侵竿ㄟ^不同的剪接方式或在不同的剪接位點(diǎn)進(jìn)行剪接，同一個(gè)前體mRNA可剪接成不同的基因表達(dá)亞型。RSK4通過可變剪接作用形成三種變異體［5］。可變剪接可產(chǎn)生蛋白質(zhì)異構(gòu)體調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡等重要過程［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)部分RSK4變異體的相互作用蛋白還涉及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，推測RSK4的可變剪接變異體1（ribosomal protein S6 kinase 4 variant 1，RSK4m1）可能與RSK4有同樣的生物學(xué)功能。本研究在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中過表達(dá)RSK4m1，觀察該細(xì)胞系的增殖、遷移及侵襲等變化，探討過表達(dá)RSK4m1對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231功能學(xué)的影響，為明確RSK4m1對乳腺癌的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫（上海）；陰性對照病毒LVCON145及RSK4m1慢病毒表達(dá)載體LV-RPS6KA6由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司構(gòu)建包裝；RSK4m1及GAPDH引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成；抗RSK4、GAPDH單克隆抗體購于美國Abcam公司；Transwell小室（孔徑8.0 μm）購于美國Corning公司；倒置相差顯微鏡購于OLYMPUS公司；酶標(biāo)儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀購于美國Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將MDA-MB-231細(xì)胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞密度長到90%左右，吸去培養(yǎng)基，PBS沖洗，胰酶消化2 min后常溫離心，吸上清液，加入新鮮培養(yǎng)基吹打均勻后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)。細(xì)胞密度達(dá)70%左右時(shí)轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞設(shè)置為3組：以MDA-MB-231親本細(xì)胞為空白對照組（Con組）、轉(zhuǎn)染空載病毒的MDA-MB-231細(xì)胞為陰性對照組（Mock組）、轉(zhuǎn)染過表達(dá)RSK4m1的MDA-MB-231細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組（OE組）。在MOI=15條件下，OE組加入LV-RPS6KA6病毒稀釋液，Mock組加入LVCON145病毒稀釋液，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔均加入終濃度為5 g/mL的Polybrene及感染增強(qiáng)液，終體積為1 mL。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換新鮮培養(yǎng)基。分別于感染24 h、48 h和72 h后在倒置熒光顯微鏡（×40）下觀察感染效率。

1.3qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)量

用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RSK4m1上游引物序列為5'-ATATGGACCCACATCAGCGG-3'，下游引物序列為5'-AGCAGCTACAGGCTCTAGGA-3'。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物序列為5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明，每組為20 μL的Real-time PCR體系，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s，變性95℃5 s，退火60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。RSK4m1的mRNA相對表達(dá)量采用2-△△Ct計(jì)算，計(jì)算公式如下：△Ct=Ct平均值（RSK4m1）-Ct平均值（GAPDH），△△Ct=△Ct（Mock組或OE組）-△Ct（Con組）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western Blot法檢測蛋白表達(dá)量

收集對數(shù)期生長的細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定每組蛋白濃度。每孔蛋白上樣量為25 μg，根據(jù)所測蛋白濃度，計(jì)算相應(yīng)的上樣體積。以10%SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入特異性抗體RSK4m1（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）4 ℃ 搖床過夜。TBST洗滌30 min后二抗室溫孵育1 h。ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行灰度值分析。蛋白相對表達(dá)量為RSK4m1與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

每組細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，加入含10%FBS培養(yǎng)基使每孔液體總量為100 μL，每組設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔，分別于 0 h、24 h、48 h、72 h 和 96 h取3個(gè)復(fù)孔行CCK-8法檢測，每孔加入10 μL CCK反應(yīng)液，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，測定450 nm處吸光度值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。記錄各組0 h、24 h、48 h、72 h和96 h的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

以標(biāo)記筆于6孔板背面筆直劃3或4條直線，每條直線間隔1 cm。取對數(shù)生長期細(xì)胞消化并接種于6孔板，3×105個(gè)/孔。待細(xì)胞基本長滿時(shí)，用 20 μL 移液槍頭垂直背面的直線劃3條寬度一致的直線，直線間隔1 cm。PBS洗滌3次，去除劃下的懸浮細(xì)胞，加入不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在光學(xué)顯微鏡下觀察0 h和24 h的細(xì)胞遷移情況，細(xì)胞遷移率（%）=（遷移距離/劃痕距離）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

將各組細(xì)胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。用50 μg/mL Matrigel（1∶8）稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，每孔約100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃下放置1 h。各組細(xì)胞消化后離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為 2×105個(gè)/mL，每孔加入細(xì)胞懸液200 μL（4×104個(gè)細(xì)胞），下室加入10%FBS培養(yǎng)基600 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。擦去上室面未穿過膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干后用1%吉姆薩染色30 min，PBS滌洗3次，200倍倒置顯微鏡下記數(shù)膜下面5個(gè)不同視野的腫瘤細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞的效率

在MOI=15條件下，用慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，綠色熒光蛋白表達(dá)率穩(wěn)定增強(qiáng)，倒置顯微鏡下觀察，熒光轉(zhuǎn)染效率＞90%。見圖1。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞48 h后的轉(zhuǎn)染效率（×40）

2.2RSK4m1 mRNA在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果（圖2）顯示，Con組、Mock組、OE組中RSK4m1 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.00±0.09、1.25±0.11、3.73±0.38，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=126.879，P<0.001）；經(jīng)兩兩比較，OE 組 RSK4m1的mRNA相對表達(dá)量高于Con組（P<0.001）和Mock組（P<0.001），Con組與Mock組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.246）。

圖2 RSK4m1 mRNA在MDA-MB-231各組細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 RSK4m1蛋白在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)

Western Blot法檢測結(jié)果（圖3）顯示，Con組、Mock組、OE組中RSK4m1蛋白的相對表達(dá)量分別為0.35±0.02、0.34±0.01、0.79±0.02，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=937.122，P＜0.001）；經(jīng)兩兩比較，OE 組RSK4m1蛋白相對表達(dá)量高于Con組（P＜0.001）和Mock組（P＜0.001），Con組與 Mock組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.908）。

圖3 RSK4m1蛋白在MDA鄄MB鄄231各組細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 過表達(dá)RSK4m1對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測各組MDA-MB-231細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)相對應(yīng)的OD值，結(jié)果顯示，與Con組和Mock組相比，OE組除0 h未見明顯差異（P=0.611）外，在24 h、48 h、72 h、96 h細(xì)胞的OD值均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 4。

圖4 過表達(dá)RSK4m1對MDA鄄MB鄄231細(xì)胞增殖能力的影響

2.5 過表達(dá)RSK4m1對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移能力變化，結(jié)果顯示，24 h后Con組、Mock組和OE組的細(xì)胞遷移率分別為（25.67±2.44）%、（24.47±2.25）%、（14.53±0.64）%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.379，P=0.001）；經(jīng)兩兩比較，OE組細(xì)胞遷移率明顯低于Con組（P＜0.001）和Mock組（P=0.001），Con組與Mock組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.480）。見圖5。

2.6 過表達(dá)RSK4m1對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲能力的變化，結(jié)果顯示，Con組、Mock組和OE組細(xì)胞穿過Transwell小室膜的數(shù)量分別為（66.70±5.86）個(gè)、（58.67±4.16）個(gè)、（35.00±5.57）個(gè)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.520，P=0.001）；經(jīng)兩兩比較，OE組細(xì)胞穿過Transwell小室膜的數(shù)量明顯低于Con組（P＜0.001）和Mock組（P=0.001），Con組與Mock組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.111）。見圖6。

圖5 過表達(dá)RSK4m1對MD A鄄MB鄄231細(xì)胞遷移能力的影響

圖6 過表達(dá)RSK4m1對MDA鄄MB鄄231細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

p90核糖體S6蛋白激酶（ribosomal protein S6 kinase，RSK）是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可使40S核糖體亞單位S6蛋白發(fā)生磷酸化而促進(jìn)某些mRNA翻譯，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖過程中起重要作用［7-8］。RSK 家族包括 RSK1、RSK2、RSK3和RSK4［9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌組織中RSK4基因表達(dá)陽性率明顯低于癌旁正常乳腺組織及乳腺良性病變組織［10］。在過表達(dá)RSK4的乳腺癌細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降［11］。干擾RSK4基因在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的表達(dá)后，能明顯促進(jìn)裸鼠原位移植瘤生長及轉(zhuǎn)移［12］。研究發(fā)現(xiàn)，RSK4可被MAPKs磷酸化激活，通過底物磷酸化抑制FGFR2-RASERK信號通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和分化。以上研究表明，RSK4可能是重要的腫瘤抑制基因，并有抑制細(xì)胞生長、增殖及侵襲的能力。

可變剪接是真核細(xì)胞基因表達(dá)多樣性的重要機(jī)制之一，同一個(gè)前體mRNA可剪接成不同的基因表達(dá)亞型?？勺兗艚釉谑荏w多樣性、控制細(xì)胞生長發(fā)育等方面起著決定性作用，來源于單一基因的不同蛋白亞型，通過與其他蛋白結(jié)合可產(chǎn)生不同的亞細(xì)胞定位、酶催化活性等［13］?？勺兗艚涌僧a(chǎn)生蛋白質(zhì)異構(gòu)體調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡等重要過程［6］。

Sun等［5］研究發(fā)現(xiàn)，RSK4除野生型外，由于第19外顯子發(fā)生15個(gè)堿基的缺失突變（-15nt）和第21外顯子的缺失突變（-E21），形成了三種變異體。該研究還發(fā)現(xiàn)RSK4對細(xì)胞生長、死亡和化學(xué)反應(yīng)的影響取決于mRNA變體或表達(dá)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體、細(xì)胞系的特異性及貼壁生長條件等。RSK4及其變異體常被發(fā)現(xiàn)在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但產(chǎn)生的作用可能部分相同，也有部分相反。本研究CCK-8實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)RSK4m1可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分別提示過表達(dá)RSK4m1可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。從一定程度上驗(yàn)證了RSK4m1可能與RSK4有同樣抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力。有研究顯示RSK4或RSK4m的相互作用蛋白參與tRNA代謝、氨基酸活化、蛋白折疊等多種細(xì)胞生理活動(dòng)，且部分RSK4m相互作用蛋白還涉及腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲，如環(huán)化酶相關(guān)蛋白1（cyclase-associated protein 1，CAP1）、α-輔肌動(dòng)蛋白 4（alpha-actinin 4，ACTN 4）等［14］?？勺兗艚右疝D(zhuǎn)錄組多樣性的方法學(xué)已成為一種有效工具，不僅可用于改善腫瘤的生物學(xué)基礎(chǔ)，還可用于尋找對診斷、治療和預(yù)后更準(zhǔn)確的分子標(biāo)志物［15］。

綜上所述，上調(diào)RSK4m1基因在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的表達(dá)可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，為RSK4m1可能作為乳腺癌治療新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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