陳昊 莫立根 鄧騰 欒方堃 于亞男 于海躍 田敏

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，具有侵襲能力強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等特點(diǎn)［1-2］。成人高級別腦膠質(zhì)瘤1年及5年生存率分別約為30%和13%，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期為1年左右［3］。近年研究表明腦膠質(zhì)瘤具有誘導(dǎo)產(chǎn)生局部和系統(tǒng)性免疫抑制的能力，可逃避機(jī)體的免疫識別和攻擊［4-5］。其中，作為“種子”的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和作為“土壤”的腫瘤微環(huán)境在腦膠質(zhì)瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用［6］。目前與免疫逃逸有關(guān)的細(xì)胞表面分子研究較多的是共刺激分子B7家族，其中負(fù)性共刺激分子PD-L1是研究的熱點(diǎn)之一［7-9］。CD133被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）的重要標(biāo)志物［10-11］，CD68在臨床及科研中被廣泛作為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）標(biāo)志物［12-13］。本研究探討不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中CD133、CD68和PD-L1的表達(dá)及其相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2017年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本60例，所有標(biāo)本手術(shù)切除后分為2份，1份立即放入液氮中，置于-80℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆?；?份放入10%中性甲醛溶液固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片備用。2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類根據(jù)膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)特征將其分為低級別膠質(zhì)瘤（Ⅰ級和Ⅱ級）和高級別膠質(zhì)瘤（Ⅲ級和Ⅳ級）［14］，本研究納入低級別腦膠質(zhì)瘤30例（低級別組），其中Ⅰ級5例，Ⅱ級25；高級別腦膠質(zhì)瘤30例（高級別組），其中Ⅲ級10例，Ⅳ級20例。60例患者中男性36例，女性24例，年齡23～65歲（中位年齡44歲），均為初發(fā)患者，術(shù)前未接受放療、化療等抗腫瘤治療，排除合并其他器官腫瘤、糖尿病和類風(fēng)濕等疾病患者及臨床、隨訪資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，患者及其家屬知情同意。兩組患者的性別、年齡等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑

小鼠抗人CD68抗體（產(chǎn)品編號：ab201973）、兔抗人PD-L1抗體（產(chǎn)品編號：ab213524）、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體（產(chǎn)品編號：ab6785）、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（產(chǎn)品編號：ab6718）購自英國Abcam公司；RNAiso Plus（產(chǎn)品編號：9108）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）購自日本Takara公司；DEPC水（產(chǎn)品編號：R0021）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗熒光衰減封片劑、DAPI溶液（即用型）、抗體稀釋液、山羊血清封閉液、PBS緩沖液、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液等購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 免疫熒光雙染實驗檢測CD68和PD-1蛋白共表達(dá)情況

腦膠質(zhì)瘤蠟塊切取4 μm厚切片，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后在檸檬酸鈉修復(fù)液（PH=6.0）中高壓煮沸5 min修復(fù)組織抗原，自然冷卻至室溫后用PBS緩沖液漂洗3遍，每次5 min；以3%過氧化氫溶液覆蓋，37℃下孵育10 min；10%山羊血清封閉液覆蓋，37℃下孵育10 min，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；甩掉血清后滴加小鼠抗人CD68抗體（1∶100）與兔抗人PD-L1抗體（1∶100）混合液，4℃孵育過夜；切片經(jīng) PBS緩沖液漂洗后滴加FITC標(biāo)記的山羊抗鼠（1∶200）和TRITC標(biāo)記的山羊抗兔（1∶200）熒光二抗混合液，37℃避光孵育1 h；PBS緩沖液漂洗后滴加DAPI溶液，避光染核2 min；抗熒光衰減封片劑封片后用熒光顯微鏡觀察并拍照分析。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。400倍鏡下，用熒光顯微鏡觀察切片并拍攝5個不同視野的熒光圖像，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光的細(xì)胞判定為CD68陽性，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈紅色熒光的細(xì)胞判定為PD-L1陽性，雙重陽性細(xì)胞呈黃色熒光。

1.4 實時熒光定量PCR檢測CD133、CD68和PD-L1 mRNA的表達(dá)

1.4.1 總RNA提取和cDNA合成 取100 mg凍存組織充分研磨至粉末狀，加入1 mL RNAiso Plus溶液混勻后轉(zhuǎn)入離心管靜置；離心后吸取上清液，加入0.2 mL氯仿，混勻；離心后吸取上清液，加入等體積異丙醇；再次離心后棄上清液，用預(yù)冷的75%乙醇清洗RNA沉淀；DEPC水溶解RNA沉淀；紫外分光光度計測定RNA濃度和A260/A280值（A260/A280需在1.7～2.1之間）；用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性。取1 μg總RNA，按照試劑盒說明書步驟合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 檢測CD133、CD68和PD-L1基因mRNA表達(dá)

以GAPDH基因作為內(nèi)參，采用Primer 5.0軟件設(shè)計GAPDH、CD133、CD68和PD-L1基因的引物序列（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。擴(kuò)增體系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各 0.8 μL，cDNA 模板 2 μL，DEPC 水6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，擴(kuò)增45個循環(huán)；然后95℃ 15 s、60℃1 min、95℃15 s，獲取融解曲線。每個樣本各目的基因設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，取平均值。

表1 GAPDH、CD133、CD68和PD-L1基因的引物序列及擴(kuò)增片段長度

1.4.3 結(jié)果判定 讀取目的基因及內(nèi)參基因的Ct值（Ct值表示基因反應(yīng)產(chǎn)物的熒光值達(dá)到設(shè)定閾值時的反應(yīng)循環(huán)數(shù)），以待測樣品的相對值表示目的基因mRNA的表達(dá)量，根據(jù)以下公式計算待測樣品的相對值：2-△Ct=2Ct（GAPDH）-Ct（目的基因），待測樣品的相對值越大，說明其表達(dá)量越多。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示；兩組腦膠質(zhì)瘤組織中CD133、CD68和PD-L1基因的表達(dá)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布則使用兩樣本比較的秩和檢驗；CD133、CD68和PD-L1基因表達(dá)水平與病理級別之間的相關(guān)性用Spearman秩相關(guān)分析法。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD68和PD-L1蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的共表達(dá)情況

免疫熒光雙染實驗結(jié)果顯示，高級別組和低級別組腦膠質(zhì)瘤組織中均有CD68和PD-L1蛋白表達(dá)，主要位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)；CD68陽性細(xì)胞呈綠色熒光，PD-L1陽性細(xì)胞呈紅色熒光，雙重陽性細(xì)胞呈黃色熒光。雙重染色結(jié)果顯示，大部分PD-L1表達(dá)于TAMs上，即大部分PD-L1陽性細(xì)胞為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞；高級別組CD68和PD-L1蛋白的共表達(dá)較低級別組明顯增加。見圖1、圖2。

圖1 CD68與PD-L1蛋白在低級別組腦膠質(zhì)瘤組織中的共表達(dá)（免疫熒光雙染，×400）

圖2 CD68與PD-L1蛋白在高級別組腦膠質(zhì)瘤組織中的共表達(dá)（免疫熒光雙染，×400）

2.2 CD133、CD68和PD-L1 mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)分級的相關(guān)性

CD133、CD68、PD-L1 和 GAPDH mRNA 的擴(kuò)增曲線和融解曲線均顯示較好的特異性，說明結(jié)果可靠。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著腦膠質(zhì)瘤組織病理級別升高，CD133、CD68和PD-L1 mRNA表達(dá)量逐漸增加；Spearman秩相關(guān)分析顯示，在腦膠質(zhì)瘤組織中，CD133、CD68和PD-L1 mRNA表達(dá)水平與病理分級呈正相關(guān)（r=0.647，P＜0.001；r=0.499，P＜0.001；r=0.445，P=0.001），見表2。

表2 CD133、CD68和PD-L1 mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)分級的關(guān)系

2.3 CD133、CD68和PD-L1 mRNA在不同病理分級腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其相關(guān)性

兩樣本比較的秩和檢驗結(jié)果顯示，CD133、CD68和PD-L1 mRNA在高級別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)均高于低級別組（P＜0.05），見表3；Spearman 秩相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中CD133與CD68 mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.525，P＜0.001），低級別組和高級別組中CD133與 CD68 mRNA的表達(dá)亦均呈正相關(guān)（r=0.518，P=0.005；r=0.500，P=0.007）；腦膠質(zhì)瘤組織中CD133與PD-L1 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.431，P＜0.001），低級別組和高級別組中CD133與PD-L1 mRNA的表達(dá)亦均呈正相關(guān)（r=0.398，P=0.036；r=0.417，P=0.027）。

表3 CD133、CD68和PD-L1 mRNA在不同病理分級腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

3 討論

腦膠質(zhì)瘤預(yù)后極差，手術(shù)、放療、化療等綜合治療后，復(fù)發(fā)率仍較高。近代病理學(xué)之父Paget提出的關(guān)于腫瘤生長的“種子與土壤”學(xué)說［15］在惡性腫瘤研究史上具有里程碑意義。在腦膠質(zhì)瘤中，作為“種子”的GSCs能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制逃避自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，具有較強(qiáng)的放療、化療抵抗性。GSCs被認(rèn)為是腦膠質(zhì)瘤的起源細(xì)胞，具有自我更新、無限增殖、自我修復(fù)和多向分化的潛能［16］。有研究［17-18］表明，GSCs所具有的逃避機(jī)體免疫監(jiān)控能力與作為“土壤”的腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞（腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和主要負(fù)性共刺激分子PD-L）密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞及其分泌的各類因子等組成，其細(xì)胞成分中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的含量最多［19］，腦膠質(zhì)瘤組織中浸潤的TAMs主要是小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（Microglia/Macrophages，M/Ms），約占腫瘤細(xì)胞團(tuán)的40%，遠(yuǎn)超淋巴細(xì)胞數(shù)量，提示TAMs可能在腦膠質(zhì)瘤免疫逃逸中扮演重要角色［20］。PD-L1為B7家族負(fù)性共刺激分子，與其受體PD-1的相互作用在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用［21］。因此，研究PD-L1蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

在腦膠質(zhì)瘤組織中，GSCs、TAMs和PD-L1同時存在，但以往報道多研究PD-L1在GSCs、TAMs各自中的表達(dá)，同時研究三者在腦膠質(zhì)瘤免疫逃逸機(jī)制中的作用，國內(nèi)外鮮見報道。本研究分析不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中CD133、CD68和PD-L1的表達(dá)及其相關(guān)性，結(jié)果顯示，在腦膠質(zhì)瘤組織中PD-L1和CD68共表達(dá)在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上，即大部分PD-L1陽性細(xì)胞為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，且隨著腦膠質(zhì)瘤病理級別升高，CD68和PD-L1蛋白共表達(dá)增加。CD133、CD68和PD-L1 mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平與病理分級呈正相關(guān)；三者在高級別組中的表達(dá)水平高于低級別組；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織中CD133與CD68 mRNA表達(dá)、CD133與PD-L1 mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)，在低級別組和高級別組中表達(dá)亦呈正相關(guān)。提示CD133、CD68和PD-L1的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，可能共同參與了腦膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展。分析原因可能是GSCs通過某種渠道誘導(dǎo)TAMs高表達(dá)PD-L1，從而逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤生長和惡性轉(zhuǎn)化。因此通過調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與其腫瘤微環(huán)境之間的雙向信息交換，從而降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和惡性轉(zhuǎn)化，或可為腦膠質(zhì)瘤的治療帶來新思路。

本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中PD-L1主要由腫瘤微環(huán)境中的TAMs表達(dá)；CD133、CD68和PD-L1表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，為進(jìn)一步探討GSCs誘導(dǎo)TAMs高表達(dá)PD-L1的分子機(jī)制和尋找腦膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)提供參考。

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