范倪 陸玉秀 唐艷萍 李科志 何盼 曹驥 陸玉雷 林有智 楊春

機體感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）后可表現(xiàn)為急、慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌，據(jù)統(tǒng)計慢性乙型肝炎感染患者中約15%以上最終發(fā)展為肝癌［1］。本課題組前期建立了實驗室人工繁育樹鼩的基本方法，用培育的圍生期樹鼩接種HBV，逐步證實HBV能在樹鼩體內(nèi)復制，部分形成慢性HBV感染狀態(tài)并逐步發(fā)生類似人類慢性乙型肝炎的病理改變［2］，對多個可影響樹鼩體內(nèi)感染HBV效率的因素［3］進行實驗篩選、優(yōu)化。Toll樣受體（toll-like receptor，TLRs）是重要的天然免疫受體［4］，在機體天然免疫反應及誘發(fā)獲得性免疫反應中起重要作用。TLR-4是最早發(fā)現(xiàn)能直接介導機體與病原反應的Toll樣受體［5］，與其配體結(jié)合后可激活信號傳導途徑，引發(fā)炎性因子IL-6、IL-8、IL-10等釋放，與慢性乙型肝炎發(fā)生密切相關(guān)［6］。也有研究發(fā)現(xiàn)TLR-4基因突變或基因多態(tài)性與肝癌發(fā)生或惡性程度密切相關(guān)［7］。本實驗通過研究新生期樹鼩HBV感染模型體內(nèi)TLR-4及其相關(guān)因子IL-6的動態(tài)變化，初步探討慢性HBV的致病機制。

1 材料與方法

1.1 感染血源的選擇

選用經(jīng)檢測HBsAg、HBeAg和HBcAb 3項指標均陽性，HBV-DNA 拷貝數(shù)為 7.53×107copies/mL（HBV基因亞型為C型）的慢性乙型肝炎患者的血清作為感染血源，分離血清，分裝后置-80℃保存。

1.2 主要試劑與儀器

TLR-4、IL-6 ELISA檢測試劑盒均購自深圳雅安達科技生物有限公司；PCR引物購自上海生物工程有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自TAKARA寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司；Trizol試劑購自Life生物公司；HBsAg檢測試劑盒購自中山生物工程有限公司；HBV-DNA檢測試劑盒購自中山達安生物技術(shù)有限公司。PCR分析儀（LightCycler480型Ⅱ）購自瑞士Roche公司。

1.3 動物來源

本研究所涉及動物實驗均嚴格遵循動物保護法進行。實驗所用的31只新生樹鼩（其中雌性16只、雄性15只）均為本實驗室用成年樹鼩（購自昆明動物研究所）雄雌合籠，自然受孕所產(chǎn)出的幼仔（約150 g）。將31只健康新生樹鼩分為實驗組（n=25）和對照組（n=6），實驗組樹鼩分別于出生第1天、第3天經(jīng)雙側(cè)大腿皮下接種300 μL HBV病毒液；對照組不做任何處理。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25～28℃，濕度60%～80%，每日清潔2 次［8］。

1.4 標本采集

血清采集為接種后分別于第8周、第12周、第16周、第20周、第24周經(jīng)樹鼩股靜脈抽血，采血0.8～1.0 mL，室溫下靜置2～3h后分離血清，4℃、4000 r/min離心15 min，置于凍存管，-80℃保存。肝組織采集為接種后第12周開始，每間隔3～6個月定期對樹鼩行麻醉后肝活檢術(shù)，術(shù)前經(jīng)臀大肌注射氯胺酮（濃度0.1 mL/100g）和腹腔皮下注射0.1%戊巴比妥鈉（濃度0.3 mL/100g）全身麻醉后，剖腹切取肝組織約100 mg，一半置于液氮中速凍，1 h后轉(zhuǎn)-80℃凍存，用于提取DNA與RNA進行分子生物學檢測；另一半置入10%中性福爾馬林液固定，用于病理組織學檢查。

1.5 樹鼩血清HBsAg和HBV-DNA病毒載量檢測

1.5.1 酶聯(lián)吸附反應（ELISA）檢測樹鼩血清HbsAg

-80℃冰箱取出血清，平衡至室溫后設(shè)置樣本陰性、陽性、空白對照孔，依次加入各樣本血清及各對照血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟進行，用酶標儀450 mm測取各孔吸光度，根據(jù)公式Cut-off值=2.1×陰性對照的均值（N）計算臨界值，判斷HbsAg陽性動物。

1.5.2 RT-PCR熒光探針法檢測樹鼩血清HBV-DNA病毒載量 提取血清DNA，向HBV反應管中各加入待檢測DNA樣本、HBV陽性質(zhì)控品、HBV陰性質(zhì)控品及陽性定量參考品，上機，PCR反應程序條件：93℃反應2 min，93℃保溫45 s，55℃ 60 s，共10個循環(huán)；93℃30 s到55℃45 s退火，共30個循環(huán)。RCR分析儀計算HBV-DNA定量值。操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。

根據(jù)血清HBsAg和HBV-DNA病毒載量將實驗組分為慢性感染組（血清HBsAg或HBV-DNA持續(xù)陽性時間達24周）和疑似慢性感染組（血清HBsAg或HBV-DNA不連續(xù)出現(xiàn)2次或2次以上陽性）。

1.6 雙抗體夾心法檢測樹鼩外周血TLR-4、IL-6蛋白表達水平

-80℃冰箱取出血清，平衡至室溫后，設(shè)置空白孔、標準品孔、樣本反應孔，加樣后嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。在酶標儀450 mm波長測量各孔吸光度；計算標準曲線的回歸方程，計算對應樣品濃度，以pg/mL為單位。嚴格按照試劑說明書進行。

1.7 RT-PCR法檢測樹鼩肝組織TLR-4、IL-6 mRNA的表達水平

-80℃冰箱取出冰凍肝組織，Trizol提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模版，進行 RT-PCR，采用 2-△△Ct法計算肝組織中 TLR-4、IL-6 mRNA的相對表達量。引物序列信息見表1。PCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL，PCR上、下游引物（10 μM）各 0.4 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddH2O 6.2 μL，總反應體系 20 μL。兩步法 PCR 擴增，反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火34 s，共40個循環(huán)，95℃延伸15 s。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計學意義，進一步的兩兩比較使用LSD檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩血清HBsAg和HBV DNA病毒載量檢測結(jié)果

在第8～24周觀察周期內(nèi)，實驗組25只接種樹鼩HBsAg和（或）HBV-DNA均陽性12只，其中慢性感染組7只，疑似慢性感染組5只，HbsAg和HBV-DNA均陰性13只（不納入研究）。對照組血清HBsAg和HBV-DNA均陰性。

2.2 雙抗體夾心法檢測樹鼩外周血TLR-4、IL-6蛋白表達水平

在第8周、第12周、第16周、第20周、第24周，慢性感染組與疑似慢性感染組樹鼩外周血TLR-4蛋白表達水平均高于對照組（P＜0.05），但慢性感染組與疑似慢性感染組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；慢性感染組與疑似慢性感染組樹鼩外周血IL-6蛋白表達水平均高于對照組（P＜0.05），慢性感染組與疑似慢性感染組第8周、第12周、第16周IL-6蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在第20周、第24周差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 RT-PCR法檢測樹鼩肝組織TLR-4、IL-6 mRNA的表達水平

第12周，疑似慢性感染組與慢性感染組IL-6 mRNA表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；慢性感染組TLR-4 mRNA表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 引物序列信息

表2 3 組樹鼩外周血 TLR-4、IL-6 蛋白水平的比較［（x±s），ng/mL］

表3 3組樹鼩肝組織中IL-6及TLR-4 mRNA表達水平的比較（x±s）

3 討論

HBV感染是我國肝癌發(fā)生的主要因素，多數(shù)肝癌發(fā)生與慢性HBV關(guān)系密切，特別是與乙型肝炎病毒復制密切相關(guān)，而機體抗HBV病毒侵擾主要通過感染早期先天免疫反應和后期病毒持續(xù)感染導致的特異免疫反應。宿主感染HBV的病程變化及不同轉(zhuǎn)歸，取決于機體對病毒免疫應答的強弱。HBV的清除應答包括強效的先天免疫和后天獲得性細胞應答，不同感染狀態(tài)可能在病毒清除過程中有不同影響［9］。HBV與先天、后天免疫之間的關(guān)系決定感染的結(jié)局［10］。

TLR-4是一類病原分子識別受體，與其配體結(jié)合后可被激活，活化信號通路，最終進入細胞核內(nèi)，啟動核內(nèi)相關(guān)基因，轉(zhuǎn)導出相應的mRNA，合成并釋放IL-6、IL-8、TNF、IFN等細胞因子，引起毛細血管通透性增高、淋巴細胞浸潤等炎癥反應，發(fā)揮早期免疫應答效應。此外，TLR-4活化可誘導表達協(xié)同刺激信號，目前已有證據(jù)表明巨噬細胞和樹突狀細胞上的協(xié)同刺激分子 B7（CD86/CD80）出現(xiàn)可能與此有關(guān)［11］。IL-6 來源于單核巨噬細胞、活化的T細胞、B細胞、成纖維細胞及上皮細胞等，為體內(nèi)重要的致炎性細胞因子。當HBV感染發(fā)生后，血清IL-6含量明顯升高，這與肝細胞受損，產(chǎn)生大量抗原免疫應答反應，使單核細胞、淋巴細胞等被激活后分泌IL-6，可調(diào)節(jié)多種急性期反應蛋白合成有關(guān)［12］。此外有研究［13］發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中TLR-4表達與NF-κB表達呈正相關(guān)，其下游炎性因子IL-6的表達量亦升高，說明TLR-4/NF-κB/IL-6通路激活可能促進肝癌發(fā)生發(fā)展。

根據(jù)2015年《乙型肝炎診斷標準》［14］，慢性乙型肝炎癥狀持續(xù)半年以上可診斷為慢性乙型肝炎感染。本研究接種的25只樹鼩，其中HBV-DNA或HBsAg出現(xiàn)2次或以上陽性12只，其中HBV-DNA和（或）HBsAg能持續(xù)24周陽性，形成慢性感染7只；另5只疑似慢性感染不連續(xù)出現(xiàn)HBV-DNA或HBsAg陽性。檢測發(fā)現(xiàn)疑似慢性感染組與慢性感染組新生樹鼩血清TLR-4、IL-6分泌水平高于對照組，表明人HBV能在新生樹鼩體內(nèi)成功感染，激活樹鼩體內(nèi)的免疫應答。其中，樹鼩血清中TLR-4和IL-6的表達量在疑似慢性感染組與慢性感染組中均較對照組明顯升高，但是疑似慢性感染組與慢性感染組間的表達量大部分時間無明顯差異?？梢奣LR-4、IL-6在HBV感染過程中均升高，與人乙型肝炎感染者的血清TLR-4、IL-6表達水平一致。本研究發(fā)現(xiàn)TLR-4與IL-6在血清中的分泌量，疑似感染組隨時間呈進行性下降趨勢，而慢性感染組保持相對恒定高水平分泌，可能是疑似慢性感染組樹鼩呈一過性感染表現(xiàn)，機體通過體內(nèi)免疫反應，引起被感染細胞凋亡，并促進機體的適應性免疫，最終清除感染病毒［15］。

進一步采用RT-PCR法檢測3組樹鼩肝組織中TLR-4及IL-6 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)疑似慢性感染組與慢性感染組樹鼩實驗第12周肝組織中TLR-4、IL-6 mRNA表達量高于對照組，說明樹鼩感染HBV后肝組織中TLR-4、IL-6持續(xù)升高，再次驗證TLR-4、IL-6在HBV感染過程中可能起重要作用。

本實驗表明，新生樹鼩感染HBV可觀察到與人感染HBV相似的免疫變化過程，說明樹鼩在感染人HBV后可產(chǎn)生與人類相似免疫應答過程，給應用樹鼩感染HBV模型研究人乙型肝炎的致病機制提供新思路。同時檢測TLR-4與IL-6可能有助于了解HBV患者機體的免疫情況，對臨床判斷病情進展程度有一定意義。此外，由于HBV持續(xù)復制可能導致肝癌發(fā)病率升高，在HBV感染早期階段采用TLR-4激動劑，抑制HBV復制從而減輕肝臟損傷可能有助于預防肝癌的發(fā)生。

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