林國(guó)享 李齡 曲頌 余彬彬 梁忠國(guó) 孫永楚 周磊 陳凱華 盧其騰 朱小東，3

c-jun基因作為轉(zhuǎn)錄因子1（activating protein-1，AP-1）的重要組成部分，與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等密切相關(guān)［1-2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）是常見的促血管生成因子，在腫瘤血管生成過程中起核心作用。研究表明，c-jun對(duì)VEGF表達(dá)有重要調(diào)控作用［3］，可調(diào)節(jié)腫瘤組織血管生成［4-5］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)通過間歇大劑量γ射線多次照射人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，成功構(gòu)建了具有穩(wěn)定放射抗拒性的人鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R［6］，并發(fā)現(xiàn)c-jun在人鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R中高表達(dá)［7］，沉默c-jun可抑制CNE-2R細(xì)胞增殖，并增加其放射敏感性［8］。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探究c-jun基因沉默對(duì)人鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞CNE-2R VEGF表達(dá)的影響，并構(gòu)建裸鼠模型觀察c-jun基因沉默對(duì)CNE-2R細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)及其血管生成的影響，以期為闡明鼻咽癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部構(gòu)建并保存；IPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自上海碧云天技術(shù)有限公司；兔抗人VEGF、c-jun及β-actin抗體購于美國(guó)CST公司，兔抗人CD34抗體購于福州邁新生物科技有限公司，山羊抗兔二抗購于上海碧云天技術(shù)有限公司；凝膠成像分析儀購自美國(guó)Bio-Rad公司；免疫組化試劑盒購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。4～6周齡實(shí)驗(yàn)用裸鼠，18～20 g/只，均為雄性，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，在SPF條件中飼養(yǎng)（合格證編號(hào)：2015000530021）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞CNE-2R分成3組：siRNA技術(shù)介導(dǎo)c-jun基因沉默的c-junshRNA-CNE-2R細(xì)胞組（c-jun-shRNA組）、陰性對(duì)照NC-shRNA-CNE-2R細(xì)胞組（NC組），以CNE-2R細(xì)胞為空白對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)CNE-2R細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CNE-2R細(xì)胞，RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，BCA法行蛋白定量。每組細(xì)胞取20 μL蛋白質(zhì)，加上樣緩沖液，12%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，分別加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000）和 β-atin抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，分別與相應(yīng)HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫?fù)u床孵育 1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析。以各組內(nèi)參基因蛋白β-atin表達(dá)量為基準(zhǔn)，ImageJ軟件分析條帶灰度值并計(jì)算各組VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 裸鼠人鼻咽癌模型的建立及鑒定 細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染后傳代培養(yǎng)4周，將4～6周齡雄性裸鼠隨機(jī)分成c-jun-shRNA組、NC組和空白對(duì)照組，每組5只。取對(duì)數(shù)期的各組細(xì)胞，將細(xì)胞消化并混懸調(diào)整濃度為2×107/mL，分別于3組裸鼠右腹股溝皮下注射細(xì)胞懸液0.2 mL/只。觀察成瘤情況，觀察腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、腫瘤體積、腫瘤大小等。2周后用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠腫瘤直徑，連續(xù)觀察6周，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積（V），繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。至第6周末處死裸鼠，完整分離瘤體并稱重，計(jì)算腫瘤體積。完整瘤組織用石蠟包埋，連續(xù)切片10張，片厚5 μm，HE染色。按成瘤的裸鼠數(shù)計(jì)算成瘤率。腫瘤體積=長(zhǎng)徑（a）×短徑（b）2×0.5。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)移植瘤組織中VEGF、CD34的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟，枸櫞酸緩沖液微波92～98℃抗原修復(fù)，3%H2O2作用10 min，加入工作液兔抗人VEGF 抗體（1∶600）、小鼠抗人 CD34（1∶100），4 ℃過夜。復(fù)溫后滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。CD34以血管內(nèi)皮為陽性對(duì)照，指標(biāo)均用PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照。

1.2.5 VEGF蛋白表達(dá)計(jì)算 VEGF蛋白表達(dá)均以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，鏡下每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，判斷染色強(qiáng)度，并計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。將染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：不著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。依據(jù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比，劃分為4個(gè)等級(jí)：0～19%為 0分、20%～39%為 1分、40%～59%為 2分、≥60%為3分。每張切片所取視野的得分取其平均值。免疫組化染色結(jié)果由2位病理科專家同時(shí)評(píng)定，以兩者之積作為最終得分，0～3分定義為低表達(dá)，6～9分定義為高表達(dá)。

1.2.6 微血管密度結(jié)果判定（microvesseldensity，MVD）

CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞并計(jì)數(shù)微血管密度。光鏡下以100倍視野選取5個(gè)微血管染色方法區(qū)（新生血管熱點(diǎn)區(qū)），然后在200倍視野下計(jì)算每一方法區(qū)中的微血管，取其平均值，即為組織的MVD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），腫瘤體積生長(zhǎng)采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-jun基因沉默后CNE-2R細(xì)胞中VEGF的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 1）顯示，c-jun-shRNA組細(xì)胞c-jun蛋白表達(dá)較NC和空白對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），表明該組細(xì)胞c-jun基因沉默效果好，成功構(gòu)建c-jun基因沉默的c-jun-shRNA-CNE-2R細(xì)胞。空白對(duì)照組VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.97±0.01，NC組為 0.99±0.01，c-jun-shRNA 組為0.48±0.03。與NC組及空白對(duì)照比較，c-jun-shRNA組細(xì)胞中VEGF的表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），而NC組及空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖13 組細(xì)胞VEGF的表達(dá)

2.2 裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況

3組裸鼠成瘤率均為100%。在第1周、第2周，3組裸鼠移植瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。c-junshRNA組裸鼠移植瘤體積增長(zhǎng)速度緩慢，體積增長(zhǎng)幅度較NC組和空白對(duì)照組小，第3～6周c-jun-shRNA組移植瘤體積明顯小于NC組和空白對(duì)照組（P＜0.05）；整個(gè)觀察期NC組及空白對(duì)照組裸鼠移植瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3 組裸鼠移植瘤體積的變化［（±s），mm3］

表1 3 組裸鼠移植瘤體積的變化［（±s），mm3］

與空白對(duì)照組比較，aP＞0.05；與空白對(duì)照組比較，bP＜0.05；與NC組比較，cP＜0.05

測(cè)量時(shí)間 空白對(duì)照組（n=5） NC組（n=5） c-jun-shRNA組（n=5）第 2 周 157.23±23.78 160.16±45.23a 155.98±35.56a第 3 周 301.43±78.46 296.49±100.45a 240.08±58.56bc第 4 周 509.67±78.67 498.35±99.87a 302.56±81.34bc第 5 周 835.31±45.73 805.05±65.63a 590.56±62.78bc第 6 周 1203.76±100.42 1196.81±90.69a 720.85±72.10bc

選取第2～6周5個(gè)時(shí)間點(diǎn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果顯示，組間效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.276，P=0.001），說明c-jun-shRNA組裸鼠移植瘤體積明顯小于空白對(duì)照組及NC組；時(shí)間效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=89.437，P＜0.001），表明3組移植瘤的體積均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，分組和時(shí)間具有交互作用（F=25.187，P=0.001）。

2.3 裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量的變化

6周觀察期結(jié)束，處死裸鼠，剝離裸鼠移植瘤組織，稱取其質(zhì)量，c-jun-shRNA 組質(zhì)量為（0.42±0.04）g，NC組為（0.80±0.08）g和空白對(duì)照組為（0.83±0.05）g。c-jun-shRNA組移植瘤移植瘤質(zhì)量較NC組及空白對(duì)照組輕（P＜0.05）；NC組與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 裸鼠移植瘤組織中VEGF的表達(dá)情況

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，VEGF陽性信號(hào)表達(dá)于組織細(xì)胞質(zhì)。NC組和空白對(duì)照組VEGF陽性信號(hào)為棕褐色，表達(dá)率均≥60%，呈強(qiáng)陽性；而c-jun-shRNA組僅呈淺黃色或不著色，表達(dá)率約30%，呈弱陽性，見圖2。c-junshRNA組移植瘤組織中VEGF表達(dá)得分為2分，NC組為6分，空白對(duì)照組為6分，c-jun-shRNA組得分明顯較NC組和空白對(duì)照組低（P＜0.05）。

2.5 裸鼠移植瘤組織中CD34蛋白的表達(dá)

用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)算微血管數(shù)，免疫組化結(jié)果示，內(nèi)皮細(xì)胞可見棕黃色或黃色顆粒（圖3），計(jì)算血管數(shù)，c-jun-shRNA組MVD為11.69±3.30，NC組為 32.56±7.33，空白對(duì)照組為 35.45±4.87，c-junshRNA組MVD較NC組和空白對(duì)照組明顯減少（P＜0.05），而空白對(duì)照組與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 3組裸鼠移植瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)（HE染色，×100）

圖3 3組裸鼠移植瘤組織中CD34蛋白的表達(dá)（HE染色，×100）

3 討論

放療是鼻咽癌的主要治療手段，但臨床上約20%的患者治療后發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［9-11］，血管生成與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制血管生成對(duì)腫瘤治療意義重大［12］。c-jun原癌基因是即刻早期基因Jun家族成員之一，與多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)。研究表明，c-jun基因或其相關(guān)信號(hào)通路的作用改變可影響腫瘤血管生成，可能參與腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程［13-15］。但目前c-jun基因?qū)Ρ茄拾┯绊懙难芯枯^少。

VEGF是一種重要的促血管形成因子，通過增加微血管的通透性和特異性，與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖，進(jìn)而導(dǎo)致新生血管生成，還可以自分泌的形式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自身生長(zhǎng)。研究表明，VEGF在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)與鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［16-17］。c-jun在VEGF的表達(dá)過程中起重要調(diào)控作用，從而調(diào)節(jié)腫瘤等組織血管生成［18］。以上研究說明，研究c-jun在鼻咽癌細(xì)胞血管生成中的作用，對(duì)抑制鼻咽癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及治療可能有重要作用。

本課題組前期研究［7-8］發(fā)現(xiàn)，沉默c-jun基因可影響CNE-2R細(xì)胞增殖、凋亡，并可提高其放射敏感性。本研究繼續(xù)采用前期研究方法，采用siRNA技術(shù)將CNE-2R細(xì)胞中的c-jun基因敲除，從體內(nèi)、體外兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ窖芯縞-jun在鼻咽癌生長(zhǎng)和血管生成中的作用。裸鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨時(shí)間延長(zhǎng)，c-junshRNA組裸鼠皮下移植瘤體積增長(zhǎng)速度明顯較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組慢，且增長(zhǎng)幅度較小，可見c-jun基因沉默可抑制鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞皮下移植瘤生長(zhǎng)，與前期研究中沉默c-jun基因可降低CNE-2R細(xì)胞增殖的結(jié)論一致。進(jìn)一步研究其可能的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)沉默c-jun基因可使CNE-2R細(xì)胞中VEGF表達(dá)水平下降；裸鼠移植瘤組織切片的免疫組化結(jié)果也發(fā)現(xiàn)c-jun-shRNA組VEGF表達(dá)較NC組及空白對(duì)照組明顯下降，說明抑制c-jun基因可使鼻咽癌組織中VEGF表達(dá)下降，提示對(duì)c-jun調(diào)控可能影響鼻咽癌腫瘤血管相關(guān)因子表達(dá)水平。進(jìn)一步檢測(cè)裸鼠移植瘤組織中CD34的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NC組和空白對(duì)照組表達(dá)均較c-jun-shRNA組高。進(jìn)行血管密度分析發(fā)現(xiàn)，c-jun-shRNA組MVD明顯低于NC組和空白對(duì)照組，再次印證c-jun可能通過影響裸鼠移植瘤血管生成，從而影響細(xì)胞增殖和組織生長(zhǎng)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)中c-jun在體內(nèi)外對(duì)VEGF表達(dá)的影響，分析其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控VEGF表達(dá)而影響移植瘤血管生成。在前列腺癌研究［19］中亦發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)c-jun相關(guān)通路，可改變c-jun表達(dá)，從而影響前列腺癌生長(zhǎng)及腫瘤血管生成。Shen等［20］研究表明c-Jun氨基末端激酶激活可通過調(diào)控VEGF表達(dá)而誘發(fā)血管生成，而cjun下調(diào)可降低腫瘤生長(zhǎng)［21］，以上研究結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，c-jun基因沉默可抑制人鼻咽癌放射抗拒性腫瘤生長(zhǎng)，通過降低VEGF表達(dá)可能抑制腫瘤血管生成。對(duì)c-jun基因與鼻咽癌放射抗拒關(guān)系的深入研究，或可為鼻咽癌放療提供新的思路。

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