唐思煜，趙優(yōu)萍，吳 迪，蔡成崗，2，3，毛建衛(wèi)，2，3

(1.浙江科技學(xué)院，生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，杭州310023;3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州310023)

桑黃(Phellinus linteus)為多孔菌科真菌火木層孔菌的子實(shí)體，是一種珍稀的食藥用真菌，隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱多孔菌目多孔菌科木層孔菌屬［1-2］。該菌在中國(guó)中南地區(qū)通常生長(zhǎng)于桑屬植物上，且其子實(shí)體為黃褐色，故名桑黃。研究發(fā)現(xiàn)桑黃含有多糖、黃酮、甾醇類物質(zhì)等多種成分［3-5］，其藥理活性物以多糖為主。目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了桑黃多糖的抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗纖維化、抗氧化、降血糖、抗炎［6-11］等藥理學(xué)方面的研究。桑黃多糖主要分胞內(nèi)多糖和胞外多糖，是桑黃中主要的有效成分，具有顯著的抗腫瘤效果和其他藥用功效，值得深入研究開(kāi)發(fā)［12］;它是目前國(guó)際公認(rèn)的生物治癌領(lǐng)域中有效率排在第一位的藥用菌［13］，市場(chǎng)需求很大，前景較好，但桑黃野生資源稀少，人工栽培難度較大［14］，價(jià)格昂貴。采用液態(tài)深層培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行桑黃發(fā)酵培養(yǎng)具有廣闊的前景，韓國(guó)已有桑黃的人工栽培和批量生產(chǎn)，但國(guó)內(nèi)對(duì)桑黃液態(tài)培養(yǎng)相關(guān)研究并不充分，也未成規(guī)模，且僅集中在液體發(fā)酵過(guò)程中碳、氮源等的篩選等方面［15-16］及理化因子的選擇上［17］。因此，本研究通過(guò)對(duì)菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化以期為桑黃液體深層培養(yǎng)和進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

1.1 菌種及試驗(yàn)材料

菌種為桑黃，由實(shí)驗(yàn)室保存。試劑為葡萄糖、蔗糖、乳糖、牛肉膏、蛋白胨、淀粉、氯化銨、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鋅。以上試劑均為分析純，購(gòu)自華東醫(yī)藥試劑公司。

1.2 儀器及設(shè)備

UV-1780紫外分光光度計(jì)，日本島津;TD4K-2離心機(jī)，湖南湘儀集團(tuán);SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，上海福瑪試驗(yàn)設(shè)備有限公司;DF-101B集熱式恒溫?cái)嚢杵?，金壇市?guó)王試驗(yàn)儀器廠;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司;QYC-211全溫空氣搖床，上海福瑪試驗(yàn)設(shè)備有限公司;LDZX-40B1型立體式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;ZY-TP電子天平，浙江凱豐集團(tuán)有限公司;MP511pH計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基

2.1.1 PDA 種子培養(yǎng)基

稱取200 g馬鈴薯煮沸30 min后，濾液加入葡萄糖20 g，定容至1 L，分裝30 mL于250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫備用。

2.1.2 碳源篩選培養(yǎng)基

碳源篩選培養(yǎng)基各成分的質(zhì)量濃度:KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 1.0 g/L、酵母粉 10 g/L，分別添加乳糖、淀粉、蔗糖至30 g/L，pH值自然，分裝50 mL于250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫備用。

2.1.3 氮源篩選培養(yǎng)基

氮源篩選培養(yǎng)基各成分的質(zhì)量濃度:KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 1.0 g/L、蔗糖 30 g/L，分別添加尿素、牛肉膏、蛋白胨和NH4Cl至10 g/L，pH值自然，分裝50 mL于250 mL的三角瓶，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫備用。

2.2 發(fā)酵條件

2.2.1 種子發(fā)酵條件

接種桑黃菌絲體于種子培養(yǎng)基，于28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

2.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件

用無(wú)菌槍頭移取2 mL種子液，接種于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基，并于28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d。

2.3 檢測(cè)方法

2.3.1 桑黃生物量測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后以4 000 r/min離心20 min，再用無(wú)菌水洗滌2次后，60℃烘干至恒重并稱重。

2.3.2 糖含量測(cè)定

還原糖含量采用DNS試劑法測(cè)定;總糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定［16］;多糖以兩者差值計(jì)算。

2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在獲得碳、氮源試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)和部分參考文獻(xiàn)［11-14］，以碳氮質(zhì)量比、MgSO4、KH2PO4和NaCl質(zhì)量濃度為因素，分別設(shè)定為因素A、B、C、D，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基組成，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

2.4.2 生長(zhǎng)過(guò)程分析

配制優(yōu)化后的培養(yǎng)基各成分質(zhì)量濃度:蔗糖 70 g/L，NH4Cl 10 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，NaCl 1 g/L，pH值自然，250 mL三角瓶裝液量50 mL，121℃滅菌20 min，冷卻后以5%接種量接種，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，每培養(yǎng)24 h取3瓶測(cè)定菌絲體質(zhì)量，結(jié)果取3組平均值，共發(fā)酵8 d。發(fā)酵液pH值用pH計(jì)測(cè)定。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用DNS法測(cè)定還原糖含量，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.306 67x－0.016 48(R2=0.993 9)，還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。采用苯酚-硫酸法檢測(cè)，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.607 08x－0.029 08(R2=0.992 3)，總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖1 DNS法測(cè)定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of reducing sugar analysis by DNSmethod

圖2 苯酚-硫酸法測(cè)定總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of total sugar analysis by phenol-sulphate acid method

3.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

以蔗糖、淀粉、乳糖等為碳源，考察不同碳源對(duì)桑黃菌絲體生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如表2所示。由表2可知，最適合桑黃生長(zhǎng)的碳源是蔗糖。

以尿素、牛肉膏、NH4Cl、蛋白胨為氮源進(jìn)行優(yōu)化，菌絲體干質(zhì)量最大的為NH4Cl，結(jié)果如表3所示。

表2 不同碳源對(duì)桑黃菌絲干質(zhì)量的影響Table 2 Effects of carbon sources on growth of Phellinus linteus

表3 不同氮源對(duì)桑黃干質(zhì)量的影響Table 3 Effects of nitrogen sources on growth of Phellinus linteus

在對(duì)碳、氮源的篩選研究中，有采用玉米粉、黃豆粉［18］作為碳、氮源，以及采用玉米粉和麥麩作為碳源，蛋白胨作為氮源進(jìn)行優(yōu)化的研究［19］，得到了較好的結(jié)果，后續(xù)可結(jié)合天然有機(jī)碳源和氮源進(jìn)行研究。

3.3 合成培養(yǎng)基篩選

正交試驗(yàn)是在碳、氮源篩選的基礎(chǔ)上，結(jié)合桑黃液體發(fā)酵適宜的碳氮質(zhì)量比(A)、MgSO4(B)、KH2PO4(C)、NaCl(D)做因素水平設(shè)計(jì)，得到最適合桑黃生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal tests

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，蔗糖70 g、NH4Cl 10 g(碳氮質(zhì)量比 70 ∶10)，NaCl、KH2PO4、MgSO4質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.5 g/L時(shí)，對(duì)桑黃菌絲體生長(zhǎng)最有利，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，得到菌絲體干質(zhì)量為2.814 g。

發(fā)酵液以4 000 r/min離心20 min得到菌絲體，再加蒸餾水洗滌2次后于60℃烘干，加20倍水研磨后浸提，離心取上清液用苯酚-硫酸法測(cè)總糖，還原糖用DNS法測(cè)定(表5)。

表5 正交試驗(yàn)桑黃菌絲體中的糖含量Table 5 Orthogonal results of polysaccharide concentrations in mycelial biomass %

由試驗(yàn)結(jié)果可知，正交試驗(yàn)中第7組總糖含量最高，還原糖含量也最高，兩者之差即菌絲體多糖含量也最高，與菌絲體干質(zhì)量含量結(jié)果一致;其次為第8組。這說(shuō)明還原糖含量增加有利于桑黃菌絲體多糖的積累。該方法以總糖與還原糖含量之差進(jìn)行多糖含量計(jì)算，可以初步反映多糖的含量，因此有必要用寡糖含量、對(duì)標(biāo)藥典等檢測(cè)方法作深入研究。

3.4 桑黃的生長(zhǎng)周期試驗(yàn)

將桑黃菌以5%接種到深層發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，從第24 h開(kāi)始測(cè)定其在培養(yǎng)192 h過(guò)程中的pH值和菌絲干質(zhì)量變化，由圖3可知桑黃在120 h時(shí)菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值，pH值在培養(yǎng)120 h前呈下降的趨勢(shì)，之后基本上趨于穩(wěn)定(圖4)。

圖3 桑黃菌絲體含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.3 Change of Phellinus ligniarius mycelium growth with time of fermentation

圖4 pH值在桑黃培養(yǎng)過(guò)程中的變化Fig.4 Change of pH value in Phellinus ligniarius culture medium during fermentation

4 結(jié)論

以菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量為主要指標(biāo)，對(duì)桑黃(鮑氏層孔菌)的深層發(fā)酵碳源和氮源進(jìn)行了初步篩選。結(jié)果表明，最適合桑黃生長(zhǎng)的碳源和氮源分別是蔗糖和NH4Cl，在此基礎(chǔ)上對(duì)桑黃發(fā)酵影響的培養(yǎng)基成分進(jìn)行了三水平四因素正交試驗(yàn)，進(jìn)一步表明，較優(yōu)的培養(yǎng)基質(zhì)量濃度為蔗糖70 g/L、NH4Cl 10 g/L、NaCl 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L，在此培養(yǎng)基下，接種量 5%，裝液量 50 mL，培養(yǎng) 7 d 得到桑黃菌絲體2.814 g。發(fā)酵進(jìn)程試驗(yàn)表明，桑黃菌絲體生成量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在120 h達(dá)到最高，隨后呈逐漸下降的趨勢(shì);發(fā)酵液pH值呈逐漸下降的趨勢(shì)，發(fā)酵120 h時(shí)基本趨于穩(wěn)定。

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