丁西飛，王彥霏，章群，徐寧

暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，廣州 510632

近年來，有害藻華(harmful algal bloom，HAB)肆虐于世界各地沿岸海域，其中有毒藻華的發(fā)生頻率明顯增加，分布范圍不斷擴(kuò)大，不僅嚴(yán)重破壞海洋生態(tài)平衡、造成漁業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，甚至危害人類健康[1]。珠江口是我國(guó)重要的水產(chǎn)增養(yǎng)殖區(qū)和漁場(chǎng)，如萬山漁場(chǎng)、珠江口漁場(chǎng)和擔(dān)桿-大星針漁場(chǎng)，同時(shí)還是重要的濱海旅游區(qū)，對(duì)我國(guó)沿海地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有重要意義[2]。然而，珠江口也是我國(guó)有害藻華高發(fā)海域之一，其赤潮發(fā)生數(shù)占南海赤潮發(fā)生總數(shù)的77%[1]。1999年珠江口海域已知的赤潮種類就已經(jīng)高達(dá)98種，并且多種藻類可能導(dǎo)致魚類甚至人類中毒[2]。研究表明，近年來珠江口的年度赤潮累積總時(shí)間和累積總面積呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，赤潮原因種由原先的硅藻、原生動(dòng)物演變成甲藻、定鞭藻等鞭毛藻，且有毒赤潮發(fā)生頻率呈上升趨勢(shì)[3]。1998年3月—4月，米氏凱倫藻發(fā)生有史以來最大規(guī)模的有毒米氏凱倫藻赤潮，造成大批魚類死亡，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)3.5億元[4]；球形棕囊藻于1997年10月—1998年2月在珠江口首次爆發(fā)[5]以來，1999年8—9月、2004年1月、2005年1月和3—5月、2006年2月均出現(xiàn)過大規(guī)模爆發(fā)，赤潮面積高達(dá)1 000 km2，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3個(gè)多月，對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的影響[6-8]；2006年3月、10—11月珠江口珠海海域先后發(fā)生3次雙胞旋溝藻赤潮，造成該海域部分網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類死亡[9]；2009年珠江口再次爆發(fā)雙胞旋溝藻赤潮，赤潮面積達(dá)300 km2[10]。許多有毒藻類在密度較低的條件下就可能對(duì)水生生物以及海洋生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害，但是目前由于分離、培養(yǎng)的困難，我們對(duì)于珠江口海域有毒藻類的種類、分布及其毒性特征仍不明確。

溶血毒素是有毒藻赤潮導(dǎo)致大量水生生物死亡的重要原因之一，其成分和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，現(xiàn)在還不十分清楚，目前只有少量溶血毒素已得知其結(jié)構(gòu)，主要為糖脂類、糖甙類和不飽和多脂肪酸類化合物，也有少數(shù)蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)[11]。不同藻分泌的溶血毒素有明顯差別。溶血毒素被認(rèn)為是一種洋地黃皂甙類似物，可能改變水生動(dòng)物細(xì)胞膜滲透性，使其成為陽(yáng)離子選擇性滲透，從而導(dǎo)致水生生物中鰓呼吸動(dòng)物，如魚、軟體動(dòng)物等的腮失去細(xì)胞選擇滲透性而導(dǎo)致死亡[12]。有研究認(rèn)為，溶血毒素作用于魚類的鰓組織，導(dǎo)致鰓組織損傷引起氧氣交換不順暢可能是引起魚類死亡的主要原因[11, 13]。溶血毒素的檢測(cè)主要是血紅細(xì)胞溶解測(cè)定法(Erythrocyte Lysis Assay，ELA)，其原理是基于溶血毒素作用于血紅細(xì)胞使之溶解破裂，從而通過吸光度的變化來判斷溶血毒素是否存在，并與已知濃度的溶血性物質(zhì)(如洋地黃皂甙)進(jìn)行比對(duì)以確定其溶血能力[14-15]。

本文以小普林藻為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)溶血毒素的測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化，旨在為海洋微藻溶血毒素測(cè)定建立一套靈敏的標(biāo)準(zhǔn)化分析方法。同時(shí)，利用兔紅細(xì)胞法分析珠江口海域分離和鑒定出的小普林藻(Prymnesiumparvum)、劇毒卡爾藻(Karlodiniumveneficum)和紅色赤潮藻(Akashiwosanguinea)的溶血毒性特征及變化規(guī)律，為珠江口海域有害藻華的防災(zāi)減災(zāi)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 藻種與培養(yǎng)

小普林藻JX12、劇毒卡爾藻JX24、紅色赤潮藻JX14、紅色赤潮藻AS2均由暨南大學(xué)水生生物研究所藻類生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。其中，小普林藻2009年11月采自珠海野貍島，由秦俊蓮分離純化。劇毒卡爾藻2011年9月采自珠海野貍島，由劉靜雅分離純化。紅色赤潮藻JX14于2011年4月采自大亞灣澳頭，由王萌分離純化。另外，紅色赤潮藻AS2由唐贏中博士分離自美國(guó)切薩皮克灣。采用f/2培養(yǎng)基[16]，基礎(chǔ)介質(zhì)為人工海水(鹽度為30.5)，置于22 ℃，光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 L：12 D[17]的人工氣候培養(yǎng)箱擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2 溶血活性標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制1.2.1 實(shí)驗(yàn)溶液配制

檸檬酸等滲緩沖液：稱取NaCl 3.412 g，檸檬酸鈉8.672 g，葡萄糖18.072 g，溶于400 mL蒸餾水中，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7.0后定容至1 000 mL備用。

0.5%兔血紅細(xì)胞溶液：白兔來自暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，取兔血10 mL于離心管當(dāng)中，350×g離心5 min，棄去血清和上層白細(xì)胞，紅細(xì)胞用pH 7的檸檬酸等滲緩沖液反復(fù)沖洗3次，再用檸檬酸等滲緩沖液把兔血稀釋成濃度為0.5%(體積比)的血紅細(xì)胞溶液，當(dāng)天使用。

全溶血溶液：0.5%的兔血紅細(xì)胞溶液，加1% (VN) Trition X-100，混勻，使血細(xì)胞完全破碎，作為全溶血溶液。

實(shí)驗(yàn)用NaCl為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，檸檬酸鈉和葡萄糖為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich GmbH，1% (VN) Trition X-100 購(gòu)自廣州譽(yù)騰生物公司。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照彭穎慧等[18]采用的洋地黃皂苷溶血活性測(cè)定方法。配制10.4 μg·mL-1洋地黃皂甙(digitonin)(購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich GmbH)溶液1 L，向6個(gè)試管中分別加入4.8 mL的經(jīng)處理的新鮮兔血紅細(xì)胞，加入洋地黃皂甙水溶液，使6個(gè)反應(yīng)管中的洋地黃皂甙的濃度梯度分別為0.52、0.78、1.04、1.30、1.56、1.86 μg·mL-1，將各反應(yīng)體系用等(滲鹽溶液(pH = 7)補(bǔ)足至6 mL。另在3個(gè)試管中加入4.8 mL經(jīng)處理的兔血紅細(xì)胞，并用檸檬酸等滲緩沖液補(bǔ)足至6 mL，作為負(fù)對(duì)照。

于37 ℃水浴避光反應(yīng)30 min后，800×g離心10 min，將上清液用紫外可見分光光度計(jì)(Gold spectrumlab 53)測(cè)定其溶血吸光度，每個(gè)濃度3個(gè)平行。

根據(jù)公式H% = (As-A0)/(A100-A0) (公式1)計(jì)算溶血百分?jǐn)?shù)。其中，As為樣品吸光度值，A0為零溶血吸光度值，A100為全溶血吸光度值。

以未加毒素的試管為負(fù)對(duì)照，以全溶血溶液為正對(duì)照。以洋地黃皂甙水溶液的終濃度為橫坐標(biāo)，以其溶血百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖。

1.3 溶血毒素的提取

采用超聲波破碎方式提取藻細(xì)胞溶血毒素，超聲波破碎均在冰浴條件下處理，藻細(xì)胞溶液維持4 ℃以下[18]。

藻細(xì)胞以10 000×g分批離心10 min，置于50 mL氯仿：甲醇：水 = 13:7:5(體積比)的混合溶液中，在4 ℃、60 W下進(jìn)行細(xì)胞破碎30 min后并鏡檢(超聲波細(xì)胞粉碎儀 JYD-900L，上海之信儀器有限公司)，破碎完畢后于分液漏斗中靜置，待完全分層后取下層溶液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中(溫度設(shè)置為60 ℃)真空干燥，真空干燥后溶解于適量甲醇(提取小普林藻毒素時(shí)甲醇的體積為培養(yǎng)液的4/100、劇毒卡爾藻為2/100、紅色赤潮藻為2/100)中，即得到溶血毒素。置于-18 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)用氯仿和甲醇均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)CNW Technologies GmbH。

1.4 小普林藻溶血毒性測(cè)定方法的優(yōu)化

取對(duì)數(shù)期小普林藻藻液1 L，密度為73.606×107cell·L-1，按照1.3所述方法提取溶血毒素，備用。

1.4.1 不同反應(yīng)溫度下的溶血活性

向試管中加入900 μL pH 7的檸檬酸等滲緩沖液和0.5%的紅細(xì)胞溶液4 800 μL，再加入備用藻毒素溶液300 μL (300 μL甲醇作為對(duì)照)，于4 ℃、20 ℃、37 ℃、50 ℃下避光反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間共60 min，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)平行。每隔10 min取反應(yīng)液于800×g離心10 min，將上清液用紫外可見分光光度計(jì)(Gold spectrumlab 53)測(cè)定溶血吸光度。根據(jù)公式1計(jì)算溶血百分?jǐn)?shù)。以未加毒素的試管為負(fù)對(duì)照，以全溶血溶液為正對(duì)照。以洋地黃皂甙水溶液的終濃度為橫坐標(biāo)，以其溶血百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖。

1.4.2 不同pH條件下的溶血活性

向試管中加入pH分別為5、6、7、8的檸檬酸等滲緩沖液900 μL和 0.5%的紅細(xì)胞溶液4 800 μL，再加入備用藻毒素溶液300 μL (300 μL甲醇作為對(duì)照)，于37 ℃避光反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間共60 min，每個(gè)pH設(shè)3個(gè)平行。每隔10 min檢測(cè)反應(yīng)液吸光度值，檢測(cè)方法與溶血百分?jǐn)?shù)計(jì)算方法同1.4.1。

1.5 小普林藻在不同生長(zhǎng)期的溶血毒性特征

分別取小普林藻對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(第8天)、穩(wěn)定期(第16天)和衰亡期(第28天)的藻液各1 L，細(xì)胞密度分別為73.606、142.839、168.849(×107cells·L-1)時(shí)進(jìn)行溶血毒素的提取，并于37 ℃、pH=8、反應(yīng)60 min條件下測(cè)定溶血毒性。每隔10 min檢測(cè)反應(yīng)液吸光度值，檢測(cè)方法同1.4.1。

1.6 3種重要赤潮藻溶血毒性的比較

分別取對(duì)數(shù)期的小普林藻、劇毒卡爾藻、紅色赤潮藻JX14和AS2株各1 L，細(xì)胞密度依次為73.606、38.857、0.427、0.759(×107cells·L-1)，按照1.3所述方法提取藻毒素，并于37 ℃、pH=8、反應(yīng)60 min條件下測(cè)定溶血毒性。每隔10 min檢測(cè)反應(yīng)液吸光度值，檢測(cè)方法同1.4.1。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 7.5和SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 溶血活性標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1是以洋地黃皂甙為標(biāo)準(zhǔn)物所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到線性回歸方程為：

y= 0.519x- 0.154 (R2= 0.953，P< 0.05)

(2)

1個(gè)溶血單位(Hemolytic Unit，HU)的定義為：在6 mL的上述反應(yīng)體系下，37 ℃反應(yīng)30 min使兔血紅細(xì)胞溶液溶解50%所需毒素的量。根據(jù)公式2計(jì)算出在溶血百分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，洋地黃皂甙濃度約為1.26 μg·mL-1。

參考文獻(xiàn)[18]給出公式計(jì)算溶血活性，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化規(guī)范：

(3)

其中，HU為溶血活性(HU·L-1)；Aw為樣品溶血后所測(cè)得的吸光值；A0為空白對(duì)照的吸光值；Ac為全溶血的吸光值；EC50為公式2中y= 50時(shí)的x值，即當(dāng)溶血百分比為50%時(shí)的洋地黃皂甙濃度(μg·mL-1)；a為公式2中擬合直線的斜率；b為公式2中擬合直線的截距；m為提取毒素蒸發(fā)步驟后，溶解毒素的甲醇與培養(yǎng)基的體積比；v為試驗(yàn)時(shí)加入反應(yīng)體系的毒素體積(L)；n為實(shí)際反應(yīng)體系的體積與1 mL的比值。

根據(jù)公式3計(jì)算出，小普林藻的溶血活性約為304.01 HU·L-1，單個(gè)細(xì)胞的溶血活性約為2.07×10-7HU·cell-1。

2.2 小普林藻溶血活性測(cè)定方法的優(yōu)化

不同pH條件下小普林藻溶血活性有很大差異(圖2A)，pH=8條件下的溶血百分?jǐn)?shù)高達(dá)20%，顯著高于pH= 5和pH= 7條件下的溶血百分?jǐn)?shù)(P< 0.01)，與pH= 6條件處理組無顯著差異(P> 0.05)，且每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的溶血百分?jǐn)?shù)都隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，并在50 min開始保持穩(wěn)定。小普林藻溶血活性隨溫度升高逐漸增強(qiáng)(圖2B)，50 ℃下測(cè)得的溶血百分?jǐn)?shù)可達(dá)到約50%，顯著高于4 ℃、20 ℃、37 ℃下的溶血百分?jǐn)?shù)(P< 0.01)，且所有實(shí)驗(yàn)組的溶血活性呈現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升的趨勢(shì)，均在40 min～50 min時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

圖1 溶血活性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of hemolysis by digitonin as an equivalent

在37 ℃、pH= 8、反應(yīng)50 min條件下，小普林藻單位體積溶血活性約為417.38 HU·L-1, 單個(gè)細(xì)胞的溶血活性約為5.67×10-7HU·cell-1。

2.3 不同生長(zhǎng)期小普林藻的溶血毒性特征

小普林藻不同生長(zhǎng)期的溶血毒性有很大差異，在整個(gè)反應(yīng)過程中，單位藻細(xì)胞溶血活性關(guān)系為對(duì)數(shù)期>衰亡期>穩(wěn)定期，單位體積溶血活性的關(guān)系為衰亡期>對(duì)數(shù)期>穩(wěn)定期。37 ℃、pH=8、反應(yīng)50 min條件下，小普林藻對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的單位細(xì)胞溶血活性分別為5.67×10-7、2.32×10-7和3.40×10-7HU·cell-1；單位體積溶血活性分別為417.38、332.70和574.27 HU·L-1。

2.4 4株有害藻類溶血毒性的比較

紅色赤潮藻JX14、小普林藻及劇毒卡爾藻的溶血毒性特征曲線表明，不同藻種溶血毒性有顯著差異(P< 0.05)，單位細(xì)胞溶血活性及單位體積溶血活性都有較大差異(圖4)。小普林藻和紅色赤潮藻JX14溶血活性隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)明顯增大，但劇毒卡爾藻溶血活性隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)無明顯變化(圖4)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，紅色赤潮藻JX14單位體積溶血活性大于或等于小普林藻，二者無顯著性差異(P> 0.05，圖4A)，而單位細(xì)胞溶血活性顯著高于小普林藻和劇毒卡爾藻(P< 0.05，圖4B)。圖5是紅色赤潮藻中國(guó)株JX14和美國(guó)株AS2溶血毒性特征曲線，可以看出，無論是單位細(xì)胞或是單位體積溶血活性，JX14均明顯高于美國(guó)株AS2，且JX14株單位細(xì)胞溶血活性高達(dá)1 050 HU·cell-1，顯著高于AS2株(P< 0.05，圖5B)。

圖2 小普林藻在不同反應(yīng)溫度和pH條件下的溶血活性Fig. 2 Effects of temperature and pH on hemolysis caused by Prymnesium parvum

圖3 小普林藻不同生長(zhǎng)期溶血毒性的變化特征Fig. 3 Hemolytic activity change tendency of Prymnesium parvum during different growth phase

37 ℃、pH=8、反應(yīng)50 min條件下，小普林藻、劇毒卡爾藻、紅色赤潮藻JX14和AS2株的單位細(xì)胞溶血活性分別為5.67×10-7、2.58×10-7、976.20×10-7和429.52×10-7HU·cell-1；單位體積溶血活性分別為417.38、100.08、417.01和326.08 HU·L-1。

3 討論(Discussion)

3.1 海洋微藻溶血活性測(cè)定方法的優(yōu)化

產(chǎn)生溶血毒素的微藻有很多種，不同藻類的溶血毒素成分不盡相同，其溶血活性反應(yīng)特征也差異很大[19]。小普林藻是一種重要的有毒赤潮藻，其產(chǎn)生的溶血毒素被認(rèn)為是導(dǎo)致大量水生物死亡的原因[20]。本研究利用容易獲取的兔血細(xì)胞為材料進(jìn)行溶血活性測(cè)試。方法簡(jiǎn)便易行且靈敏度高，可用于有毒赤潮藻的溶血活性檢測(cè)。從本研究所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出，在溶血百分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，洋地黃皂甙濃度約為1.26 μg·mL-1，這與彭喜春等[13]、崔偉民等[14]采用兔血紅細(xì)胞、何家菀等[21]采用牛血紅細(xì)胞所做結(jié)果(1.3 μg·mL-1)相似，大于江濤等[22]及Kuroda等[23]的結(jié)果。

本研究顯示，在4～50 ℃范圍內(nèi)，小普林藻溶血活性隨溫度升高及實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而增大，并在反應(yīng)50 min時(shí)趨于穩(wěn)定。溫度是維持哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞體積穩(wěn)定的重要條件，維持細(xì)胞體積穩(wěn)定是細(xì)胞正常發(fā)揮其功能的基礎(chǔ)[24-25]，溫度為37 ℃時(shí)紅細(xì)胞的形狀和結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定；37 ℃之后，隨溫度升高，紅細(xì)胞的形狀和結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定[26]，越容易受外界條件影響而破裂。因此，本研究結(jié)果不能確定是由于50 ℃對(duì)小普林藻溶血毒性起促進(jìn)作用而導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，還是因?yàn)?0 ℃遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物正常體溫而使紅細(xì)胞變形本身較易破裂。因此，可以認(rèn)為37 ℃為測(cè)試小普林藻溶血活性的最佳實(shí)驗(yàn)溫度。Ulitzer和Shilo[27]研究表明，小普林藻的溶血活性在10～37 ℃下隨溫度升高、時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)；崔偉民等[14]報(bào)道的米氏凱倫藻在4 ℃、20 ℃和37 ℃時(shí)，溶血活性隨溫度升高、時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，這均與本研究結(jié)果相一致。另外，宋秀凱等[28]報(bào)道的多變魚腥藻(AnabaenavariabilisOLS1)和Emura等[29]報(bào)道的泰勒亞歷山大藻(Alexandriumtaylori)所產(chǎn)生的毒素的溶血活性都在4 ℃、18 ℃、37 ℃下隨溫度的升高而升高，且18 ℃、37 ℃時(shí)，藻溶血活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大，也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但在4 ℃時(shí)，多變魚腥藻及泰勒亞歷山大藻的溶血活性基本完全被抑制，這與本實(shí)驗(yàn)4 ℃條件下結(jié)果有所不同，說明不同藻種的溶血活性對(duì)溫度的反應(yīng)趨勢(shì)相近，溶血活性都隨實(shí)驗(yàn)溫度的升高及實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但對(duì)低溫的反應(yīng)卻不盡相同。

圖4 小普林藻、劇毒卡爾藻及紅色赤潮藻的溶血毒性特征Fig. 4 Hemolytic activity of Prymnesium parvum, Karlodinium veneficum and Akashiwo sanguinea

圖5 2株紅色赤潮藻的溶血毒性比較Fig. 5 Hemolytic activity of two strains of Akashiwo sanguinea

Ulitzer和Shilo[27]認(rèn)為pH對(duì)于溶血毒性的影響可能是由于pH的改變可以改變毒素的電離狀態(tài)，增加或者減少它的疏水性及其穿過細(xì)胞膜的能力。本研究表明，小普林藻毒素在pH 5～8條件下，pH 8時(shí)溶血活性有最大值，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，溶血活性隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，且在50 min趨于穩(wěn)定。類似的，Valenti等[30]對(duì)小普林藻卡特株(P.parvum)的研究表明，pH是決定小普林藻對(duì)魚類毒性的重要因素，并且小普林藻暴露于pH= 8.5的環(huán)境中時(shí)對(duì)于呆鰷魚(Pimephalespromelas)的毒性明顯高于pH=7.5及pH=6.5時(shí)的毒性；Bertin等[31]的研究也表明，小普林藻的溶血毒性在pH=8.5時(shí)最高。這都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說明相同藻種不同藻株毒素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)可能較為相似，且小普林藻溶血毒性可能在弱堿性的條件下最高。而葛蔚等[32]認(rèn)為赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)的溶血活性在pH=6和pH=7時(shí)最高，超過75%，遠(yuǎn)大于在pH=5和pH=8時(shí)的溶血活性，赤潮異彎藻表現(xiàn)出在中性偏酸的環(huán)境中溶血活性最高。Malovrh等[33]報(bào)道的小定鞭藻在pH < 5時(shí)表現(xiàn)出溶血活性；何家菀等[21]認(rèn)為，小定鞭藻的溶血活性在pH為7～9時(shí)隨pH的增大而減小；彭喜春[34]的研究表明，球形棕囊藻在pH 7時(shí)溶血活性最強(qiáng)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因可能是藻毒素種類、親水端結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)因藻種藻株的不同而存在較大的差異。

3.2 小普林藻不同生長(zhǎng)期的溶血毒性特征

藻類毒素的合成與其生長(zhǎng)周期有著密切的關(guān)系，其合成機(jī)制十分復(fù)雜。本研究結(jié)果顯示，小普林藻對(duì)數(shù)期單位藻細(xì)胞溶血活性最強(qiáng)、衰亡期次之。需要特別指出的是，本研究采用懸浮藻細(xì)胞測(cè)定溶血活性，并不包含培養(yǎng)液部分。而藻細(xì)胞死亡、裂解后毒素會(huì)釋放至培養(yǎng)液中，因此培養(yǎng)液中(尤其是衰亡期)會(huì)逐漸積累藻毒素。換言之，包含培養(yǎng)液測(cè)定得出的溶血毒素含量會(huì)顯著高于懸浮藻細(xì)胞測(cè)定的結(jié)果。類似的，海洋卡盾藻CMHK、COHK、米氏凱倫藻KMEC和赤潮異灣藻HAEC均是在對(duì)數(shù)期溶血活性最高[35]。江天久等[36]也證實(shí)亞歷山大藻在對(duì)數(shù)期內(nèi)單個(gè)藻細(xì)胞的石房蛤毒素(STX)含量最高，在穩(wěn)定期顯著下降。另有研究發(fā)現(xiàn)，小定鞭藻PPEC的藻細(xì)胞濾液產(chǎn)生的溶血毒素峰值出現(xiàn)在穩(wěn)定期[35]，強(qiáng)壯前溝藻和卵圓卡盾藻的溶血活性在衰亡期達(dá)到最高值，對(duì)數(shù)期藻細(xì)胞的溶血活性其次[37-38]。Emura等[29]研究發(fā)現(xiàn)泰勒亞歷山大藻(A.taylori)自指數(shù)期開始分泌毒素，在衰亡期仍保持較高的溶血活性。這些研究表明不同藻種的溶血活性在不同生長(zhǎng)期的變化趨勢(shì)是不盡相同的。Yasumoto等[39]研究認(rèn)為，藻類毒素的產(chǎn)生可能與某些藻類的自我保護(hù)機(jī)制有關(guān)，隨著水體中營(yíng)養(yǎng)元素不斷被消耗，藻類在穩(wěn)定期或衰亡期合成一些能抑制其他競(jìng)爭(zhēng)生物生長(zhǎng)繁殖的次生代謝產(chǎn)物，從而使產(chǎn)毒藻在競(jìng)爭(zhēng)中處于優(yōu)勢(shì)地位。

3.3 不同有害藻類溶血毒性的比較

劇毒卡爾藻曾在美國(guó)切薩皮克灣、馬里蘭州海灣和澳大利亞天鵝坎寧河口等多處爆發(fā)過大規(guī)模赤潮，造成了嚴(yán)重的死魚事件，其原因則是該藻釋放溶血毒素?fù)p傷魚鰓導(dǎo)致魚類窒息而死[40]。周成旭等[41]也研究發(fā)現(xiàn)分離自我國(guó)東海海區(qū)的劇毒卡爾藻具有顯著的溶血活性；小普林藻為全球廣布種，在歐洲、澳大利亞、摩洛哥和以色列、美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)的沿海和內(nèi)陸水體頻繁形成有毒藻華，引發(fā)大量魚類死亡[42]，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1986年，陳椒芬和曾呈奎[43]首次報(bào)道小普林藻在我國(guó)的出現(xiàn)；何家菀等[21]確認(rèn)小定鞭藻含有引起魚類死亡的魚毒素以及引起哺乳動(dòng)物等紅血球細(xì)胞溶解的溶血毒素。紅色赤潮藻赤潮在煙臺(tái)[44]和廈門[45]均有發(fā)生，藻類的大量繁殖影響了魚、蝦、貝類的生長(zhǎng)，特別是導(dǎo)致了鮑魚幼蟲的死亡率升高對(duì)當(dāng)?shù)氐暮．a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有巨大的影響，同時(shí)給人們的生活帶來不便。但目前對(duì)于紅色赤潮藻是否是由于產(chǎn)生毒素而導(dǎo)致水生生物死亡還存在爭(zhēng)議。本研究通過對(duì)分離自珠江口的紅色赤潮藻、小普林藻和劇毒卡爾藻進(jìn)行溶血特征研究，發(fā)現(xiàn)3種藻均檢測(cè)出較強(qiáng)的溶血毒性。紅色赤潮藻單位藻細(xì)胞的溶血活性為976.19×10-7HU·cell-1，顯著高于小普林藻和劇毒卡爾藻，這可能是由于紅色赤潮藻的細(xì)胞體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小普林藻和劇毒卡爾藻。紅色赤潮藻單位體積溶血活性為417.01 HU·L-1，也遠(yuǎn)高于米氏凱倫藻64.69 HU·L-1[14]和球形棕囊藻21 HU·L-1[13]。這是首次在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)確認(rèn)紅色赤潮藻具有較高的溶血活性。此外，來源不同的2株紅色赤潮藻溶血活性具有顯著差異，中國(guó)株JX14無論是單位體積或是單位細(xì)胞的溶血活性都高于美國(guó)株AS2。類似的，周成旭等[46]研究發(fā)現(xiàn)赤潮異彎藻的2個(gè)品系H1和H2對(duì)鯽魚紅細(xì)胞的溶血活性有明顯差異，H2品系的去藻上清液溶血活性可達(dá)100%，H1品系溶血活性僅為60%。這表明同一藻種的不同株系可能因環(huán)境的不同，其溶血毒性也會(huì)存在較大差異。珠江口地處熱帶、亞熱帶，氣候溫和，物種豐富，浮游生物種類繁多，浮游植物會(huì)受到更多的攝食和競(jìng)爭(zhēng)威脅。因此，藻類在較大的環(huán)境壓力下可能會(huì)通過增加自身毒性的方式來抵御外界的捕食，或者通過釋放溶血毒素從而獲取更多營(yíng)養(yǎng)并形成競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

有害藻華往往伴隨著大量的水生生物死亡現(xiàn)象，其溶血毒素往往是重要原因之一。珠江口是我國(guó)有害藻華高發(fā)海域之一，1998年珠江口海域曾爆發(fā)嚴(yán)重的米氏凱倫藻赤潮和紅色赤潮藻赤潮，對(duì)當(dāng)?shù)睾ＫB(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[14, 47]。王朝暉等[48]發(fā)現(xiàn)，米氏凱倫藻可能會(huì)分泌一種溶血毒性或細(xì)胞毒性脂類，損傷魚鰓組織造成壞死從而引發(fā)魚類死亡。Xu等[49]研究表明，紅色赤潮藻對(duì)多種水生生物(對(duì)蝦、鯔魚)都有毒害作用。近年來珠江口地區(qū)多次爆發(fā)紅色赤潮藻赤潮，并伴隨大量死魚現(xiàn)象，雖然目前珠江口海域尚未報(bào)道過小普林藻和劇毒卡爾藻赤潮的發(fā)生，但是這2種赤潮在美洲、澳洲、歐洲等其他地區(qū)常有發(fā)生[42, 50]。本研究對(duì)從珠江口海域分離的小普林藻、劇毒卡爾藻、紅色赤潮藻進(jìn)行溶血毒性分析，發(fā)現(xiàn)它們均具有顯著的溶血毒性，并且分離自珠江口的紅色赤潮藻藻株溶血毒性顯著高于美國(guó)株。因此，鑒于其強(qiáng)烈的致害作用，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)這幾種重要赤潮藻溶血毒性的關(guān)注及深入研究，這對(duì)于了解和監(jiān)測(cè)珠江口赤潮災(zāi)害有十分重要的意義。

通訊作者簡(jiǎn)介：徐寧(1971-)，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事藻類生理生態(tài)方面的研究，發(fā)表各類論文40余篇。

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