王玉榮 沈 馨 董 蘊 尚雪嬌 郭 壯

(湖北文理學院食品科學技術(shù)學院，湖北 襄陽 441053)

鲊廣椒又稱鲊海椒、鲊金椒或鲊辣椒，是中國云南、貴州、四川和成都等少數(shù)民族地區(qū)的特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品，湖北省恩施、襄陽、宜昌和荊門亦有制作和食用鲊廣椒的習俗[1]。不同地區(qū)因物產(chǎn)資源不同，其制作原料和工藝亦有較大的不同[2]，宜昌地區(qū)通常使用大米面、鮮紅辣椒、玉米面和食鹽為主要原料進行鲊廣椒制備。由于使用原料及制作工藝的不同，鲊廣椒中微生物菌群信息可能豐富而復雜，因而不同農(nóng)戶家庭制作的鲊廣椒品質(zhì)存在較大的差異。值得一提的是，目前市場上尚無成熟的鲊廣椒產(chǎn)品，因而全面系統(tǒng)地解析其微生物多樣性信息，對實現(xiàn)鲊廣椒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)可能具有積極的意義。

Miseq測序技術(shù)具有通量高、檢測速度快和檢測結(jié)果準確的特點[3]，實現(xiàn)了對某一微生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)全面、客觀、無偏地揭示。目前已在發(fā)酵肉制品[4]、濃香型白酒窖泥[5]、發(fā)酵果酒[6]、發(fā)酵蔬菜[7]、飲用水[8]和發(fā)酵茶[9]微生物群落結(jié)構(gòu)解析中有著廣泛的應用。作為一種新穎的檢測復雜風味的儀器，電子鼻由具有選擇性的化學傳感器陣列和模式識別系統(tǒng)構(gòu)成[10]，目前已應用在肉制品加工[11]、農(nóng)產(chǎn)品檢測[12]和發(fā)酵制品風味識別[13]等領域。

本研究從湖北省宜昌市當陽地區(qū)農(nóng)戶家中采集了8 個鲊廣椒樣品，在解析樣品細菌微生物群落結(jié)構(gòu)的基礎上，進一步依據(jù)便攜式電子鼻系統(tǒng)對不同樣品揮發(fā)性物質(zhì)的響應差異進行了測定，探討了細菌多樣性對鲊廣椒風味的影響，以期為后續(xù)鲊廣椒用發(fā)酵劑的制備及鲊廣椒的產(chǎn)業(yè)化提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

鲊廣椒樣品：從宜昌市農(nóng)戶家中使用一次性采樣勺采集8 份鲊廣椒樣品，每個樣品約采集30 g并裝入無菌采樣管中保存。樣品采集后迅速置于含有冰袋的采樣箱中，冷鏈運送回實驗室，于-80 ℃冰箱中冷凍貯存以備用；

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit：德國QIAGEN公司；

FastPfu Fly DNA 聚合酶、三磷酸脫氧核糖核苷酸混合液、其他PCR反應試劑：北京全式金生物技術(shù)有限公司；

引物338F、引物806R：由天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要儀器設備

高通量測序平臺：Miseq PE300型，美國Illumina公司；

便攜式電子鼻(配置W1C、W5S、W3C、W6S、W5S、W1S、W1W、W2S、W2W和W3S 10 個金屬氧化物半導體型化學傳感元件)：PEN3型，德國Airsense公司；

機架式服務器：R920型，美國DELL公司；

凝膠成像分析系統(tǒng)：UVPCDS8000型，美國UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴增及高通量測序 取1.0 g榨廣椒，使用DNA 提取試劑盒對微生物宏基因組進行提取，并以此為模板進行細菌16S rRNA V3-V4區(qū)擴增。擴增體系：10 ng DNA模板，0.4 μL 5 U/μL DNA聚合酶，0.8 μL 5 μmol/L 正向引物，0.8 μL 5 μmol/L反向引物，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs mix，4 μL 5×PCR緩沖液，體系用ddH2O補充至20 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s， 35 個循環(huán)重復后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物使用Miseq PE300型平臺進行高通量測序。

1.2.2 序列優(yōu)化及質(zhì)控 按照序列間的重疊關系對Miseq PE300型平臺下數(shù)據(jù)進行拼接，在拼接過程中要求重疊區(qū)的堿基數(shù)≥10 bp或最大錯配比率≤0.2，同時要求引物堿基錯配數(shù)≤2 bp，且切除引物后序列的長度在50 bp以上，若序列不符合上述條件則予以剔除。

1.2.3 生物信息學分析 應用QIIME平臺(v1.70)進行生物信息學分析[14]：① 在使用PyNAST對序列排齊的基礎上[15]，按照100%相似性進行序列UCLUST歸并[16]；② 按照97.0%的相似度，將16s rRNA V3-V4區(qū)集中的序列進行分類操作單元(Operational taxonomic units，OTU)劃分；③ 使用Ribosomal Database Project[17]和Greengenes[18]數(shù)據(jù)庫明確各OTU的分類學地位；④ 在使用FastTree軟件[19]繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹的基礎上計算α多樣性；⑤ 在計算UniFrac距離的基礎上計算β多樣性。

1.2.4 優(yōu)勢及核心菌群的定義 若某一細菌屬或OTU的平均相對含量≥1.0%，則將其定義為優(yōu)勢菌屬或OTU；若在所有樣品中均存在則將其定義為核心菌屬或OTU；若在所有樣品中均存在且相對平均含量>1.0%，則將其定義為優(yōu)勢核心菌屬或OTU。

1.2.5 核酸登錄號 序列提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(http: //metagenomics.anl.gov/)，登錄號為mgp80896。

1.2.6 鲊廣椒風味品質(zhì)的評價 在室溫下(25 ℃)，準確稱取3.0 g鲊廣椒樣品于樣品瓶中，使用PEN3型便攜式電子鼻對樣品進行檢測，待傳感器信號穩(wěn)定后選定49，50，51 s為信號采集時間，并將3 個點的平均值作為最終結(jié)果。每個樣品平行做3 次重復。

1.2.7 多元統(tǒng)計學分析 在構(gòu)建電子鼻各傳感器響應值與對應樣品各細菌屬相對含量矩陣的基礎上，使用皮爾森相關性分析法計算兩者間的相關系數(shù)，同時選取絕對值>0.5的指標，采用Cytoscape軟件繪制相關性網(wǎng)絡圖；將核心OTU相對含量開平方后，采用熱圖(Heatmap)對結(jié)果進行展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

納入本研究的8 個鲊廣椒樣品16S rRNA測序基本信息見表1。

質(zhì)量控制后，本研究共獲得了256 094條高質(zhì)量序列，根據(jù)100%相似性進行序列UCLUST歸并后得到68 316條代表性序列，根據(jù)100%相似性進行OTU劃分后得到3 853個OTU，其中12.48%的OTU不能鑒定到屬水平。以測序深度為自變量，發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)為因變量，對測序深度是否滿足后續(xù)生物信息學分析的要求進行評估，納入本研究8 個樣品的稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)見圖1。

表1 測序基本信息?

? 在測序深度為12 610條序列時，計算發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)。

圖1 稀疏曲線圖和香農(nóng)指數(shù)圖

由圖1可知，即使測序量達到本研究的單個樣品最大測序量42 568條時，稀疏曲線亦沒有進入平臺期，然而當測序量僅為2 000條左右時，香濃曲線已基本達到平衡狀態(tài)。由此可見，即使本研究單個樣品最小測序產(chǎn)出量僅有12 668條序列(樣品ZGJ8)，其測序深度亦足以滿足后續(xù)分析。

2.2 基于門屬水平鲊廣椒細菌豐度分析

在鲊廣椒樣品中共發(fā)現(xiàn)20個門的細菌，其中相對含量>1.0%的門為Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)，其相對含量分別為84.07%，13.88%，1.29%。由此可見，鲊廣椒樣品中的細菌微生物主要隸屬于Firmicutes和Proteobacteria 2個門。本研究進一步對鲊廣椒樣品中優(yōu)勢細菌屬的相對含量進行了比較分析，結(jié)果見圖2。

圖2 鲊廣椒屬水平主要細菌豐度

由圖2可知，F(xiàn)irmicutes中相對含量>1.0%的屬分別為Lactobacillus(乳酸桿菌屬，77.33%)、Weissella(魏斯氏菌屬，2.24%)、Pediococcus(片球菌屬，2.18%)和Staphylococ-cus(葡萄球菌，1.27%)。此外，隸屬于Proteobacteria的Carnimonas(肉胞菌屬)和Enterobacter(腸桿菌屬)及隸屬于Bacteroidetes的Prevotella(普氏菌屬)平均相對含量亦>1.0%，分別為5.66%，2.47%，1.05%。由此可見，當陽地區(qū)鲊廣椒主要是由若干個隸屬于Firmicutes和Proteobacteria已知的優(yōu)勢細菌屬組成。值得一提的是，Lactobacillus、Enterobacter、Pediococcus和Prevotella在8 個樣品中均存在，其累計含量分別為83.03%，而Carnimonas僅在樣品ZGJ8中存在，其相對含量高達45.29%。

目前市場上常用的乳酸桿菌菌株多分離自健康人體腸道、傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品或泡菜中，本研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus為鲊廣椒中的優(yōu)勢細菌屬，其平均相對含量高達77.33%，且Weissella和Pediococcus等隸屬于Lactobacillales(乳桿菌目)的乳酸菌在鲊廣椒中的累計平均相對含量達4.42%。當陽地區(qū)鲊廣椒由大米面、玉米面、新鮮辣椒和食鹽等原料混合固體發(fā)酵而成，其發(fā)酵方式和基質(zhì)與傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和泡菜有著較大的差異，因而將鲊廣椒作為新的乳酸菌菌株的分離源并積極開展乳酸菌菌種資源的收集和保藏工作，對中國商業(yè)化乳酸菌的開發(fā)利用及相關食品產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展可能具有一定的積極意義。

本研究發(fā)現(xiàn)Prevotella為當陽地區(qū)鲊廣椒樣品中的優(yōu)勢細菌屬之一，其相對含量為1.05%，且與風味物質(zhì)的形成具有積極的作用。有研究[20]指出長期食用低動物蛋白低脂肪和高碳水化合物的志愿者腸道內(nèi)該菌平均相對含量較高，并認為其與碳水化合物的代謝有關。鲊廣椒原料富含碳水化合物，且發(fā)酵條件為厭氧環(huán)境，這可能是Prevotella相對含量較高的原因之一。然而值得注意的是，Prevotella為人體腸道中的優(yōu)勢細菌屬[21]，在樣品采集過程中，本研究發(fā)現(xiàn)鲊廣椒制作和發(fā)酵環(huán)境相對開放，因而鲊廣椒中Prevotella是由原料中帶入還是制作環(huán)境較差因糞便污染引起的是一個值得進一步研究的問題。此外，F(xiàn)aecalibacterium和Roseburia亦為人體腸道的優(yōu)勢菌群[21]，本研究亦發(fā)現(xiàn)各有1個OTU隸屬于上述2個細菌屬，但其平均含量僅分別為0.041% 和0.025%。

本研究發(fā)現(xiàn)Staphylococcus和Enterobacter均為當陽地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢細菌屬之一，其平均含量分別為1.27%和2.47%，且有1個核心OTU隸屬于Klebsiella和Nocardia。Staphylococcus廣泛地分布于自然環(huán)境中，雖多數(shù)為非致病菌，但少數(shù)可導致疾病發(fā)生，隸屬于該屬的金黃色葡萄球菌(S.aureus)是人類化膿感染中最常見的病原菌，可在加工、貯藏和運輸過程中對食品造成污染[22]。Enterobacter亦廣泛存在于自然環(huán)境中，能引起多種腸道外的條件致病性感染，隸屬于該菌屬的阪崎腸桿菌(E.Sakazakii)能引起新生兒腦膜炎和敗血癥，死亡率高達75%[23]。作為Klebsiella中常見的種，肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)對人致病性較強，是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌之一[24]。作為好氣性腐生菌，Nocardia能同化多種碳水化合物，星狀諾卡氏菌(N.asteroides)對人或動物具有致病性[25]。Carnimonas具有一定的嗜鹽性，可以在臘肉制品表面形成黑色斑點[26]，從而導致肉制品失去食用價值并造成經(jīng)濟損失，本研究發(fā)現(xiàn)ZGJ8中Carnimonas相對含量高達45.29%，且其與有機硫化物等風味物質(zhì)的生成呈現(xiàn)正相關。由此可見，由于制作環(huán)境相對開放，當陽地區(qū)鲊廣椒中不僅存在Lactobacillus等有益菌，而且存在著少量的有害微生物或腐敗菌，因而優(yōu)化鲊廣椒加工環(huán)境顯得尤為重要。此外，在對鲊廣椒中乳酸菌進行發(fā)掘和收集的基礎上，篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵特性的菌株并進行發(fā)酵劑制備，可能對鲊廣椒食用安全性的提升和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要的意義。OTU在8 個鲊廣椒樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計見圖3。

由圖3可知，在所有樣品中均出現(xiàn)的OTU僅有10個，但其包含的序列數(shù)為31 600條，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的12.34%。由此可見，雖然鲊廣椒主要是由若干個隸屬于Firmicutes和Proteobacteria已知的優(yōu)勢細菌屬組成，但是在OTU(按照序列97.0的相似性進行劃分)水平上，鲊廣椒樣品間微生物構(gòu)成存在較大的差異，所有樣品僅有12%左右的核心菌群。進一步對10個核心OTU在各鲊廣椒樣品中的相對含量進行了比較分析，其結(jié)果見圖4。

圖3 OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計

圖4 核心OTU相對含量的熱圖

由圖4可知，本研究甄別出的10個核心OTU，其中2個隸屬于Bacillus，各有1個隸屬于Lactobacillus、Pediococcus、Faecalibacterium(糞棲桿菌屬)、Roseburia(羅氏菌屬)、Nocardia(諾卡氏菌屬)、Ralstonia(青枯菌屬)、Klebsiella(克雷伯氏菌屬)和Enterobacter。各核心OTU在樣品中的分布也存在較大的差異，例如OTU1177(Lactobacillus)在ZGJ1和ZGJ7中的相對含量分別為29.87%和20.12%，但在其他樣品中的相對含量均<1.0%，OTU88(Enterobacter)在ZGJ4中的相對含量達到12.62%，但在其他樣品中的相對含量<1.0%。由此可見，雖然存在于所有樣品中，但核心OTU在各樣品中的平均含量差異較大。

作為世界上危害最大、分布最廣和造成損失最嚴重的植物病害之一，青枯病常由Ralstonia的細菌引起。本研究發(fā)現(xiàn)有1個核心OTU隸屬于Ralstonia，究其原因可能在鲊廣椒的加工過程中，居民使用了患有青枯病的辣椒作為輔料，從而將該腐敗菌帶入了產(chǎn)品中。由此可見，辣椒的選擇可能是后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)加工過程中的關鍵控制點之一。

2.3 基于多元統(tǒng)計學分析的鲊廣椒細菌微生物構(gòu)成研究

進一步在OTU水平，采用基于加權(quán)UniFrac距離的UPGMA聚類分析對不同鲊廣椒樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)相似性進行了分析，結(jié)果見圖5。

圖5 基于加權(quán)UniFrac距離的聚類分析

由圖5可知，樣品ZGJ1、ZGJ2、ZGJ3和ZGJ7的細菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，而樣品ZGJ8的細菌群落結(jié)構(gòu)與其他樣品存在較大差異，可能與其特有的Carnimonas及其相對含量(高達45.29%)有關。

本研究以16S rRNA V3-V4區(qū)為測序靶點，采用Miseq 高通量測序技術(shù)對當陽地區(qū)鲊廣椒中微生物群體的物種組成及豐度進行了揭示，打破了傳統(tǒng)微生物學基于純培養(yǎng)研究的局限性。然而，雖然Miseq 高通量測序技術(shù)具有通量高、檢測速度快和檢測結(jié)果準確的特點，但存在讀數(shù)短的缺點，所以為保證分析結(jié)果的準確性，本研究僅能在屬水平上對當陽地區(qū)鲊廣椒中細菌的多樣性進行揭示。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，PacBio SMRT(single molecule real-time 單分子實時)測序技術(shù)已在乳制品[27]和腸道微生物[28]研究中有了一定的應用，在解析微生物多樣性和豐富度均較高的復雜基質(zhì)研究方面顯示出了較大的技術(shù)優(yōu)勢，將該技術(shù)引入到鲊廣椒及傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性研究中具有積極的意義。

2.4 鲊廣椒風味品質(zhì)的評價

基于電子鼻技術(shù)鲊廣椒樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)的分析見表2。

表2 基于電子鼻技術(shù)鲊廣椒樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)的分析

由表2可知，除W6S外其他9個傳感器對鲊廣椒樣品的響應差異均較大，變異系數(shù)均在10%以上，說明各鲊廣椒樣品的風味品質(zhì)存在較大差異。值得一提的是，W1W和W2W 2個傳感器對樣品ZGJ8的響應值均最大，分別為134.96% 和56.75%，說明該樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)中有機硫化物含量可能較高。

2.5 鲊廣椒優(yōu)勢細菌屬及風味物質(zhì)的關聯(lián)性分析

在對鲊廣椒細菌多樣性和風味品質(zhì)進行揭示及評價的基礎上，對樣品中優(yōu)勢細菌屬相對含量和電子鼻各傳感器響應值之間的相關性進行了關聯(lián)計算，并構(gòu)建了相關性網(wǎng)絡圖，結(jié)果見圖6。

實線表示正相關，虛線表示負相關

由圖6可知，Weissella和Carnimonas與有機硫化物等風味物質(zhì)的生成呈現(xiàn)正相關，而Lactobacillus與其呈現(xiàn)負相關。除此之外，Prevotella與芳香型化合物的生成呈現(xiàn)正相關，而與氮氧化物、乙醇、氫氣和甲烷等物質(zhì)的形成呈現(xiàn)負相關。由此可見，Lactobacillus和Prevotella對鲊廣椒風味的形成具有積極的作用。

3 結(jié)論

本研究在對8 個鲊廣椒樣品細菌微生物群落結(jié)構(gòu)進行解析的基礎上，進一步探討了細菌多樣性對產(chǎn)品風味品質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)鲊廣椒中細菌微生物主要是由若干個隸屬于Firmicutes和Proteobacteria已知的優(yōu)勢菌屬組成，且Lactobacillus和Prevotella對鲊廣椒風味的形成具有積極的作用。雖然通過本研究的開展，彌補了目前關于鲊廣椒細菌群落結(jié)構(gòu)研究尚少的不足，然而本研究亦存在樣本量偏少和采樣地點單一的缺陷，因而在后續(xù)研究中進一步增加樣本量同時設置多個采樣點進行樣品采集是極為必要的。

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