孫益榮吳 敬宿玲恰

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學(xué)教育部食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

角質(zhì)酶是一種多功能水解酶，可用于水解短鏈或長鏈脂肪酸酯類和甘油三酯，也可用于降解植物的多聚體角質(zhì)[1-2]。相較于普通的脂肪酶，角質(zhì)酶缺少了蓋子結(jié)構(gòu)，更易于降解聚酯。基于以上功能特點(diǎn)，角質(zhì)酶在食品加工和紡織工業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[3-6]，尤其在棉織物的生物精煉和人造纖維的表面改性中，角質(zhì)酶有望替代傳統(tǒng)的化學(xué)堿處理，對環(huán)境保護(hù)有重要意義。

目前角質(zhì)酶的主要來源包括微生物和花粉2種，其中微生物來源又可細(xì)分為致病真菌、部分細(xì)菌和少數(shù)放線菌三部分[7]。國內(nèi)外的研究早期集中在植物病原真菌Fusariumsolanipisi[8]、Pyrenopezizabrassicae[9]來源的角質(zhì)酶上，后續(xù)又篩選得到放線菌Thermobifidafusca[1]、Streptomycesacidiscabies[3]和細(xì)菌Pseudomonasputida[10]等產(chǎn)角質(zhì)酶菌株。絕大多數(shù)角質(zhì)酶，諸如ThermobifidaFusca角質(zhì)酶，適用溫度范圍為30～60 ℃。而特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens，H.insolens)角質(zhì)酶最適溫度為80 ℃，并有良好的耐熱性。在此應(yīng)用溫度下，棉纖維表層的蠟質(zhì)會因高溫融化，有利于角質(zhì)酶與角質(zhì)的結(jié)合，提升酶應(yīng)用效能。因此，特異腐質(zhì)霉來源的角質(zhì)酶具有更好的應(yīng)用前景。為了更好地生產(chǎn)角質(zhì)酶，構(gòu)建工程菌生產(chǎn)重組蛋白是目前研究的主要方式。因而選擇合適的表達(dá)宿主顯得尤為重要。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為目前研究最深入、開發(fā)最成熟的一種表達(dá)系統(tǒng)，具有培養(yǎng)周期短、表達(dá)效率高、遺傳相對穩(wěn)定、操作相對簡便的特點(diǎn)[11]，是生產(chǎn)異源蛋白最常用的系統(tǒng)之一。

本試驗(yàn)擬將Humicolainsolens來源的角質(zhì)酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)，測定其酶學(xué)性質(zhì)，并在3 L發(fā)酵罐的水平上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及條件優(yōu)化，為H.insolens角質(zhì)酶在工業(yè)中的應(yīng)用及后續(xù)的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

H.insolens角質(zhì)酶基因、克隆宿主E.coliJM109、表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)、表達(dá)載體pET 20b(+)：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；

克隆載體pMD18-T simple vector：寶生物工程(大連)有限公司；

PCR引物：生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.2 主要試劑

DNA Marker、瓊脂糖、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NcoI和Hind III、堿性磷酸酶(CIAP)及PCR聚合酶PrimeSTAR：寶生物(大連)工程有限公司；

氨芐青霉素(Amp)：分析純，生工生物(上海)工程有限公司；

異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)：分析純，阿拉丁生化(上海)科技有限公司；

普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒：天根生化(上海)科技有限公司；

分子級胰蛋白胨和酵母粉：英國Oxoid公司；

蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白質(zhì)凝膠電泳試劑盒：碧云天(上海)生物科技有限公司；

其它試劑：分析純，國藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.0 g/L、酵母粉 5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L；

TB培養(yǎng)基：甘油 5.0 g/L、胰蛋白胨 12.0 g/L、酵母粉 24.0 g/L、K2HPO4·3H2O 16.43 g/L、KH2PO42.35 g/L；

3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基：工業(yè)級蛋白胨 1.2 g/L、工業(yè)級酵母粉 2.4 g/L、甘油 8.0 g/L、KH2PO413.5 g/L、(NH4)2HPO44.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、檸檬酸 1.7 g/L、微量元素液10 mL，用氨水(氫氧化銨)調(diào)pH 7.0；

3 L罐補(bǔ)料培養(yǎng)基：工業(yè)級蛋白胨 2.4 g/L、工業(yè)級酵母粉 4.8 g/L、MgSO4·7H2O 18.35 g/L、甘油600.0 g/L；

微量元素液：Al2(SO4)3·18H2O 2.0 g/L、CoSO4·7H2O 0.75 g/L、H3BO30.5 g/L、MnSO4·7H2O 24.0 g/L、Na2MoO43.0 g/L、NiSO4·6H2O 3.0 g/L、ZnSO4·7H2O 1.0 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)NcoI 和Hind III的引物，使用PCR儀擴(kuò)增特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶對pET20b(+)載體使用NcoI、Hind III雙酶切，CIAP處理防止載體自連，膠回收后獲得線性化的載體。在T4 ligase體系下將基因同載體連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。對獲得的轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒，經(jīng)NcoI、Hind III雙酶切驗(yàn)證正確，即質(zhì)粒pET20b(+)/HIC。質(zhì)粒由生工生物工程(上海)有限公司測序。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pET20b(+)/HIC轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選和LB/AMP培養(yǎng)基培養(yǎng)后，使用濃度為15%的甘油管保藏菌種，于-80 ℃冷凍保藏。

1.2.2 重組菌誘導(dǎo)表達(dá) 取保藏的特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶重組菌接種于LB/AMP培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)8 h后，轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基中，接種體積分?jǐn)?shù)5%；37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600約為1.5時(shí)，加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG，于25 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h左右，直至發(fā)酵液中的角質(zhì)酶酶活不再增高。

1.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳檢測 洗凈并組裝制膠裝置，用水檢漏，確保裝置不漏水。依據(jù)試劑盒配方配置分離膠，混勻后加入到裝置內(nèi)，用水液封。于37 ℃烘箱靜置30 min，待分離膠凝固后用濾紙除去裝置中殘留的水。配置濃縮膠，加入到槽內(nèi)，插入梳子，室溫下等待濃縮膠凝固。取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL和5 μL的上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min，上樣8 μL。設(shè)置電泳儀電壓300 V，電流60 mA，運(yùn)行20 min左右，當(dāng)藍(lán)色條帶到達(dá)凝膠底部時(shí)停止。輕輕地將凝膠與制膠板分開，剝下的膠用考馬斯亮藍(lán)染液染色45 min左右。按照水、乙醇、冰乙酸16∶1∶3的比例配置脫色液，用于蛋白膠脫色，約12～20 h可脫色完全。

1.2.4 酶活力測定方法ρNPB水解酶活性：在37 ℃下，使用連續(xù)分光光度法測定酶活力。反應(yīng)總體積為1.5 mL，包括30 μL 50 mmol/L對硝基苯丁酸酯(ρNPB)的底物，30 μL酶液，和1 440 μL Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)。在405 nm波長下，記錄對硝基酚的增長速率，反應(yīng)時(shí)間1 min。酶活定義：37 ℃下，每分鐘將對硝基苯丁酸酯(ρNPB)催化水解生成1 μmol 對硝基酚的酶量，即為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.5 重組菌最適溫度及最適pH測定

(1) 最適溫度：分別在不同溫度條件下測定同等量的角質(zhì)酶活力，最高酶活力定義為100%，計(jì)算不同溫度條件下的相對酶活，探究最適溫度。

(2) 最適pH：在不同pH條件下(pH 5.0～10.0)測定等量酶液的酶活，定義最高酶活為100%，計(jì)算不同條件下角質(zhì)酶的相對酶活，探究最適pH。

(3) 緩沖體系為：Na2HPO4-NaH2PO4緩沖體系(5.0～7.0) 、Tris-HCl緩沖體系(pH 7.0～9.0)和Gly-NaOH緩沖體系(pH 9.0～10.0)。

1.2.6 重組菌溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性測定

(1) 溫度穩(wěn)定性：取同等量的酶液，分別置于60，80 ℃ 的水浴鍋中保溫處理，60 ℃樣品間隔120 min取樣一次，80 ℃ 樣品間隔5 min取樣一次，測定樣品酶活力。定義0 h樣品的酶活為最高酶活100%，計(jì)算角質(zhì)酶殘留酶活在不同溫度下隨時(shí)間的變化情況，探究該酶的溫度穩(wěn)定性。

(2) pH穩(wěn)定性：取不同pH值(pH 5.0～10.0)條件下的酶液，于室溫靜置48 h，取等量酶液測定酶活，最高酶活定義為100%，計(jì)算不同pH條件下的角質(zhì)酶殘留酶活變化情況，探究角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定性。緩沖體系同1.2.5(3)。

1.2.7 3 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng) 將保藏的甘油管，以2%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至50 mL工業(yè)級LB培養(yǎng)基中，并添加終濃度為0.1 g/L的氨芐青霉素，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。取上述種子以10%的接種體積分?jǐn)?shù)，轉(zhuǎn)接至3 L NBS BioFlo-115型發(fā)酵罐中，起始裝液量為1 L(包括900 mL的3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基和100 mL種子)。維持生長溫度37 ℃、溶氧30%，通過補(bǔ)加氨水的方式維持pH 7.0。培養(yǎng)5～7 h后，上罐培養(yǎng)基中的碳源耗盡，溶氧反彈。此后以指數(shù)流加的方式向發(fā)酵罐中加入補(bǔ)料培養(yǎng)基至發(fā)酵結(jié)束，比生長速率控制在μ=0.18 h-1。補(bǔ)料階段6～8 h，在菌體生長至特定OD后進(jìn)入乳糖誘導(dǎo)階段，恒速流加0.2 g/(L·h)的乳糖溶液，誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度由對應(yīng)的發(fā)酵策略決定。誘導(dǎo)后，間隔一定時(shí)間取樣，測定樣品的菌濃(OD600)和酶活，當(dāng)酶活出現(xiàn)顯著下降趨勢后結(jié)束發(fā)酵。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)NcoI 和Hind III的引物，使用PCR儀克隆并擴(kuò)增目的基因HIC。同pET20b(+)載體連接后，轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。對獲得的轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒，NcoI、Hind III雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。從圖1可知，600 bp處出現(xiàn)目的條帶，與H.insolens角質(zhì)酶基因的理論大小相符，重組質(zhì)粒pET20b(+)/HIC構(gòu)建完成。

2.2 重組角質(zhì)酶在大腸桿菌中的表達(dá)

將構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒 pET20b(+)/HIC轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至搖瓶中，依據(jù)1.2.2所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，24 h酶活達(dá)到最大值，此后保持穩(wěn)定，據(jù)此結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液中的胞外酶活為170 U/mL、胞內(nèi)酶活<1 U/mL，總酶活170 U/mL。發(fā)酵上清液的蛋白電泳圖見圖2。從圖2可知，20 kDa處有明顯的條帶，與HIC的理論相對分子質(zhì)量一致，表明H.insolens來源的角質(zhì)酶基因HIC已在大腸桿菌中正確表達(dá)。

M. DNA Marker 1. 質(zhì)粒pET20b(+)/HIC經(jīng)NcoI/HindIII雙酶切后的條帶

圖1 重組質(zhì)粒pET20b(+)/HICNcoI、Hind III雙酶切電泳圖

Figure 1 Restriction enzyme digestion analysis of pET20b(+)/HIC

M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(高) 1.H.insolens角質(zhì)酶重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基上清液組分

圖2 重組菌搖瓶發(fā)酵胞外上清液SDS-PAGE分析

Figure 2 SDS-PAGE analysis of culture supernatant of recombinant strains

2.3 重組角質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適pH和pH穩(wěn)定性 從圖3(a)可知，伴隨pH值的改變，重組角質(zhì)酶酶活出現(xiàn)明顯變化，pH處于5.0～8.5時(shí)，相對酶活逐漸上升；pH處于8.5～10.0時(shí)，相對酶活逐漸降低；說明重組酶最適pH值為8.5。從圖3(b)可知，pH 5.0～10.0時(shí)，放置48 h酶活幾乎無變化。

2.3.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 從圖4(a)可知，30～80 ℃時(shí)，相對酶活呈逐漸上升趨勢；80～85 ℃時(shí)，相對酶活逐漸下降，說明重組酶的最適反應(yīng)溫度為80 ℃。從圖4(b)、(c)可知，重組角質(zhì)酶80 ℃條件下的溫度半衰期為11 min，60 ℃ 條件下溫度半衰期為14 h。

2.4 重組角質(zhì)酶在3 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)時(shí)間對高密度發(fā)酵的影響 重組菌于3 L罐發(fā)酵過程中，誘導(dǎo)時(shí)間會顯著地影響到菌體濃度和異源蛋白的表達(dá)量。誘導(dǎo)時(shí)間過早，會對宿主菌的生長造成負(fù)擔(dān)，降低細(xì)胞生長速率，影響到異源蛋白的正常表達(dá)。誘導(dǎo)時(shí)間過晚，會導(dǎo)致誘導(dǎo)強(qiáng)度不足，最終影響到蛋白表達(dá)量[12]。為探求最佳的誘導(dǎo)時(shí)間，獲得最高的重組角質(zhì)酶蛋白表達(dá)量，本研究中統(tǒng)一控制發(fā)酵罐誘導(dǎo)溫度為30 ℃、乳糖濃度為0.2 g/(L·h)，分別在菌濃OD600為30，40，50，65時(shí)開始恒速流加乳糖溶液，測定各誘導(dǎo)階段的菌體生長情況和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見圖5。

圖3 重組角質(zhì)酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

圖4 重組角質(zhì)酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響

從圖5可知，當(dāng)菌體濃度OD600為30時(shí)開始乳糖誘導(dǎo)，菌體生長和蛋白表達(dá)受到顯著影響，最終導(dǎo)致重組菌于OD600為82時(shí)即停止生長，其最高酶活僅為1 766 U/mL；當(dāng)菌體濃度OD600為40時(shí)開始乳糖誘導(dǎo)，菌體最終生物量(OD600)和蛋白表達(dá)情況亦受到一定影響，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活為2 150 U/mL；當(dāng)菌體濃度OD600為50時(shí)開始乳糖誘導(dǎo)，菌體生長狀況良好，蛋白正常表達(dá)，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活為2 233 U/mL；當(dāng)菌體濃度OD600為65時(shí)開始乳糖誘導(dǎo)，OD600為100后菌體生物量達(dá)到最高，此后逐漸下降，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活為1 934 U/mL。OD600為50時(shí)誘導(dǎo)的菌體生長及蛋白表達(dá)情況均優(yōu)于OD600為30，40，65時(shí)誘導(dǎo)的，故本研究認(rèn)為OD600為50時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.4.2 誘導(dǎo)溫度對高密度發(fā)酵的影響 誘導(dǎo)溫度是影響菌體生長和重組蛋白產(chǎn)量的因素之一。溫度較低時(shí)菌體生長速率降低，菌體濃度低，進(jìn)而影響重組蛋白的表達(dá)；溫度過高，細(xì)胞內(nèi)多肽鏈合成速度加快，當(dāng)合成速率大于折疊速率后，會造成多肽鏈聚集而無法正確折疊，最終以不溶性包涵體的形式沉積。故選擇最合適的誘導(dǎo)溫度，對提高重組菌株在3 L發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶量有重要意義。

依據(jù)2.4.1的試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)菌體濃度OD600達(dá)到50后進(jìn)入誘導(dǎo)階段，此時(shí)分別選擇3種不同的溫度(25，30，35 ℃)，統(tǒng)一恒速流加[0.2 g/(L·h)]乳糖溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，以測定不同誘導(dǎo)溫度對重組蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果見圖6。從圖6可知，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，菌體生長緩慢，菌體生物量OD600為84時(shí)即停止生長，蛋白表達(dá)亦受到抑制，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活為1 565 U/mL，為3種溫度下的最低值。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，菌體生物量OD600最高為104，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活為2 233 U/mL。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為35 ℃時(shí)，菌體生長情況最好，菌體生物量OD600最高達(dá)到114，但是重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活僅為1 772 U/mL，明顯低于30 ℃時(shí)的，其原因可能是過高的溫度和過快的菌體生長速度，導(dǎo)致蛋白不正常折疊形成大量沒有活性的包涵體，故認(rèn)為30 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

圖6 誘導(dǎo)溫度對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響

3 結(jié)論

角質(zhì)酶可有效降解棉纖維表層角質(zhì)，增強(qiáng)纖維潤濕性，在紡織工業(yè)中有很好的應(yīng)用前景。但是，工業(yè)中處理棉纖維的常用方法，均需在高溫環(huán)境下進(jìn)行才能保證處理效果。而目前已報(bào)到的角質(zhì)酶基因來源，催化溫度偏低，在實(shí)際使用時(shí)需多次改變溫度、工藝復(fù)雜，工業(yè)化應(yīng)用受到了明顯的限制。本試驗(yàn)為解決上述問題，嘗試在E.coli中重組表達(dá)了H.insolens來源的角質(zhì)酶基因，重組后的角質(zhì)酶最適溫度高達(dá)80 ℃，在高溫應(yīng)用環(huán)境下可保持一段時(shí)間的穩(wěn)定。進(jìn)一步將重組酶在3 L罐中進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，確定了重組酶的最佳誘導(dǎo)溫度為30 ℃，菌體濃度OD600為50時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)為最佳誘導(dǎo)時(shí)間，獲得的最高酶活可達(dá)2 233 U/mL。本研究可為角質(zhì)酶在棉織物精練工業(yè)中的應(yīng)用提供新的研究思路，而且簡化工藝流程、降低生產(chǎn)成本。

但由于本試驗(yàn)在3 L罐中的發(fā)酵罐數(shù)較少，存在優(yōu)化不徹底的問題，重組酶的表達(dá)仍處于較低水平。因此，在后續(xù)研究中，應(yīng)圍繞誘導(dǎo)強(qiáng)度和重組蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝。其次，在優(yōu)化過程中，還應(yīng)考慮到該角質(zhì)酶具有磷脂水解活性的特點(diǎn)，在重組菌發(fā)酵過程中可能會對宿主細(xì)胞膜造成損傷，因而發(fā)酵過程中平衡誘導(dǎo)強(qiáng)度、菌體濃度及蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系也是十分關(guān)鍵的。如果能很好地解決上述問題，獲得更好的蛋白表達(dá)及更短的發(fā)酵周期，將會對降低角質(zhì)酶生產(chǎn)成本有重要的意義。

[1] CHEN Sheng, TONG Xing, WOODARD R W, et al. Identification and characterization of bacterial cutinase[J]. J Biol Chem, 2008, 283(38): 25 854-25 862.

[2] 李江華, 劉龍, 陳晟, 等. 角質(zhì)酶的研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(12): 1 829-1 837.

[3] FETT W F, GéRARD H C, MOREAU R A. Cutinase production byStreptomycesspp[J]. Curr Microbiol, 1992, 25(3): 165-171.

[4] JOHAN S. Laundry detergent and/or fabric care compositions comprising a modified transferase: US, 6410498[P]. 2002-06-25.

[5] CHEN Sheng, SU Ling-qia, CHEN Jian, et al. Cutinase: characteristics, preparation, and application[J]. Biotechnology Advances, 2013, 31(8): 1 754-1 767.

[6] LOOMER S, ADLERCREUTZ P, MATTIASSON B. Triglyceride interesterification by lipases 1: Cocoa butter equivalents from a fraction of palm oil[J]. J Am Oil Chem Soc, 1990, 67: 519-524.

[7] KOLATTUKKUDY P E P R E, MAITI I B. Cutinases from fungi and pollen[J]. Methods Enzymol, 1981, 71(81): 652-664.

[8] MANDY A M A H, WOLFGANG Z. Cutinase production byFusariumoxysporumin liquid medium using central composite design[J]. Biotechnol Lett, 2006, 28(1): 681-685.

[9] LI Dong, ASHBY A M, JOHNSTONE K. Molecular evidence that the extracellular cutinase Pbc1 is required for pathogenicity ofPyrenopezizabrassicaeon oil seed rape[J]. Mol Plant Microbe Interact, 2003, 16(6): 545-552.

[10] SEBASTIAN J C A K, KOLATTUKKUDY P E. Discovery of a cutinase-producingPseudomonassp. cohabiting with an apparently nitrogen-fixingCorynebacteriumsp. in the phyllosphere[J]. J Bacteriol, 1987, 169(1): 131-136.

[11] CORREA A, OPPEZZO P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins inE.coli: advantages of high-throughput screening[J]. Biotechnol J., 2011, 6(6): 715-730.

[12] 姜琪, 宿玲恰, 吳敬, 等. 共表達(dá)磷脂酶 C 促進(jìn)葡萄糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的胞外表達(dá)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2017, 36(3): 236-242.