呂國英 王 霄 宋婷婷張作法*

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兩株野生桑黃液體發(fā)酵產物抗氧化活性比較

呂國英1王 霄2宋婷婷1張作法1*

（1. 浙江省農業(yè)科學院園藝研究所，浙江 杭州 310021；2. 浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310014）

以采自四川和安徽的兩株野生桑黃液體發(fā)酵所得的菌絲體和發(fā)酵液為比較分析對象，檢測其抗氧化活性。結果表明，發(fā)酵液和菌絲體對DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的清除能力均較強，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性；黃酮含量與抗氧化活性基本呈正相關；安徽菌株A的抗氧化活性略優(yōu)于四川菌株S。

桑黃；液體發(fā)酵；抗氧化

桑黃（s）是一種大型藥用真菌，主要生長在桑樹等活立木上[1,2]。桑黃提取物具有明顯的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫等一系列藥理作用，目前已成為藥用真菌研究領域的熱點[3]。由于桑黃有嚴格的寄主選擇和特殊的環(huán)境要求，自然界中子實體生長緩慢，且大量的人工采伐導致野生桑黃越來越少。桑黃雖能人工栽培，但所需條件苛刻，獲得效率低下，目前難以實現(xiàn)規(guī)模化栽培。桑黃較容易分離培養(yǎng)，菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)能獲得大量的代謝物，有些活性物質含量比子實體還要高，而且生產周期短、易于控制，不受季節(jié)氣候限制，并可自動化控制規(guī)?；a[4]。對其活性成分研究最多的是多糖抗腫瘤活性，其次為抗氧化作用。

本研究以兩株野生桑黃液體發(fā)酵后菌絲體和發(fā)酵液為指標，考察其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力，以期為該種藥用真菌的功能性成分提取和保健產品的開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：桑黃菌株S和A，分別采自四川和安徽的活桑樹，經分離純化獲得，保存在本實驗室。試劑： DPPH、ABTS、過硫酸鉀購自Sigma；其他的試劑為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基（g/L）配方：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。PDA液體培養(yǎng)基（g/L）配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。

1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

從活化的斜面培養(yǎng)基上取一定量的菌絲塊接種到裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，150 r/min、25 ℃下振蕩培養(yǎng)8天。

1.4 樣品制備

將發(fā)酵液進行減壓抽濾，收集抽濾所得的濾液，為發(fā)酵培養(yǎng)液（S培和A培），用于測定抗氧化活性。

1.5 DPPH清除率的測定

1 mL樣品加入1 mL 0.01%的DPPH溶液（乙醇︰二甲基亞砜=1︰1的溶液溶解），振蕩反應30 min后，在517 nm處測定吸光度。以純溶劑代替同樣體積的樣品作為空白[5]。

DPPH清除率（%）=（1－A517樣品/A517空白）×100%。

1.6 ABTS+清除率的測定

配制2.46 mM過硫酸鉀，用過硫酸鉀溶解ABTS，配成7 mM ABTS儲備液，在室溫、避光條件下靜置12～16 h；將ABTS+以磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH=7.4）稀釋，使其吸光度在734 nm波長處達到0.7±0.02。然后取4 mL的ABTS+測定液，加入40 μL的樣品待測液，準確振蕩30 s，在734 nm處測定吸光度[6]。

ABTS+清除率（%）=（1－A734樣品/ A734空白）×100%。

1.7 羥自由基清除率的測定

1 mL樣品加入1 mL FeSO4（12 mmol/L），再加入1 mL H2O2（12 mmol/L），37 ℃下保溫10 min，再加入1 mL 6 mmol/L的水楊酸，37 ℃下保溫30 min，然后10 000 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清液在510 nm處測定吸光度。以純溶劑代替同樣體積的樣品作為空白[7]。

1.8 黃酮含量的測定

標準曲線的制作：準確稱取25.0 mg蘆丁標準品，用80%乙醇溶解并定容至50.0 mL，即為標準液。標準液分別稀釋為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，各取1 mL，加60 μL 5%的NaNO2，搖勻，靜置5 min，加入60 μL 10%的Al(NO3)3，混勻，靜置6 min，加入0.8 mL 1 M的NaOH溶液，再補充80 μL純水/或者80%乙醇至2 mL總體積。反應10 min，在510 nm下測試吸光度，用80%乙醇代替同樣體積的樣品作為空白。做3組平行測試，最終吸光度值為3次測試的平均值[8]。

以反應體系中蘆丁標準品的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標作標準曲線，計算回歸方程為y = 2.019 9x + 0.046 3，2= 0.996 3。

2 結果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

有自由基清除劑存在時，·DPPH的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)是成化學劑量關系的。因此可用于檢測自由基的清除情況，從而評價實驗樣品的抗氧化能力。幾個不同濃度梯度的樣品進行了DPPH清除率的測定，結果見表1。

可以看出，兩個菌株菌絲體和發(fā)酵液均有良好的·DPPH清除能力。菌株A（安徽）的清除效果略優(yōu)于菌株S（四川）；特別是稀釋64倍的A菌株發(fā)酵液的清除率達到100%，完全可以忽略空白培養(yǎng)基本身的清除能力。說明有一大部分的抗氧化物質分泌在細胞外。菌株A優(yōu)于菌株S。

表1 發(fā)酵樣品DPPH清除率

注：1/4，1/16等表示稀釋4倍，16倍；培養(yǎng)基空白表示滅菌后未接種。

2.2 清除ABTS+的能力

ABTS經過硫酸鉀氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介質中，在734 nm處有最大吸收。被測物質加入ABTS+溶液后所含抗氧化成分能與ABTS+發(fā)生反應而使反應體系褪色。結果如表2。

可以看出，菌株A的菌絲體和發(fā)酵液的ABTS+清除率都明顯優(yōu)于菌株B；菌株A的發(fā)酵液稀釋16倍后，清除率為94.5%，盡管空白培養(yǎng)基有較大的干擾，但稀釋16倍后基本可以忽略其影響。菌株A明顯優(yōu)于菌株S。

表2 發(fā)酵樣品ABTS+清除率

注：1/4，1/16等表示稀釋4倍，16倍；培養(yǎng)基空白表示滅菌后未接種。

2.3 清除羥自由基的能力

H2O2和Fe2+混合產生羥自由基，在體系內加入水楊酸，可捕捉羥自由基并產生有色物質，該物質在510 nm處有最大吸光值。當反應體系中存在·OH自由基清除劑時，此氧化過程受到抑制，吸光度值則降低，通過測定A510，可以間接測定樣品的·OH自由基清除能力。

兩種菌株發(fā)酵液對羥自由基清除能力明顯低于對前兩種自由基的清除能力（表3），空白培養(yǎng)基本身的清除能力對結果產生一定的干擾；菌絲體的羥自由基清除效果仍很明顯。菌株S效果略優(yōu)于菌株A。

表3 發(fā)酵樣品羥自由基清除率

注：1/2，1/4等表示稀釋2倍，4倍；培養(yǎng)基空白表示滅菌后未接種。

2.3 黃酮含量

黃酮是一類天然產物，廣泛存在于植物和真菌的次級代謝產物中，具有抗癌、抗衰老、抗炎、降血糖、降血壓、調節(jié)內分泌等多種功能，還可有效地清除羥自由基等，是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑[9]。本研究中空白的培養(yǎng)液510 nmAbs為0，故可以排除培養(yǎng)液所含物質對吸光度的干擾。安徽菌株A的發(fā)酵培養(yǎng)液中黃酮含量為5.25 mg/mL，明顯高于四川菌株S的2.89 mg/mL（圖1）；菌絲體的黃酮含量安徽菌株A略優(yōu)于四川菌株S。發(fā)酵培養(yǎng)液的總黃酮含量要高于菌絲體的細胞破碎液，說明隨著菌種的新陳代謝，有大量的黃酮類物質被排出細胞外，進入培養(yǎng)液中。

圖1 樣品中的黃酮含量

3 結論與討論

研究表明，癌癥、衰老或其他疾病大都與過量自由基的產生有關，能夠消除過多的氧化自由基，對于許多自由基引起的及與老化相關的疾病都能起預防作用。本研究中選取幾種典型的自由基為對象，考察桑黃發(fā)酵物對其清除能力。結果顯示，安徽菌株優(yōu)于四川菌株，特別是安徽菌株發(fā)酵液稀釋64倍，DPPH清除率仍達到100%。兩種菌的發(fā)酵液在稀釋的情況下對幾種自由基的清除率都可以達到100%，這與發(fā)酵液中黃酮含量高有關。黃酮類化合物因酚羥基上的氫原子可與過氧自由基結合生成黃酮自由基，進而與其他自由基反應，從而終止自由基鏈式反應[9, 10]。而黃酮類物質在植物中普遍存在，但在大型真菌中則很少見。

本研究評價了在液體培養(yǎng)條件下桑黃的抗氧化能力，為其生物活性的研究奠定了基礎，同時也為進一步開發(fā)利用該藥用真菌提供了理論依據(jù)。

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浙江省“十三五”食用菌育種專項（項目編號：2016C02057-8）

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