杜 彬，魏克強

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

煙草的固有成分及其燃吸后釋放的化學(xué)物質(zhì)決定了煙草煙氣化學(xué)成分的組成，因此，不同基因型煙草煙氣的化學(xué)成分具有明顯的差異[1-3]，煙氣暴露產(chǎn)生的毒理學(xué)效應(yīng)也有所不同[4-6]。通過比較不同基因型煙草煙氣化學(xué)成分的體內(nèi)毒理學(xué)效應(yīng)，有助于指導(dǎo)“降毒減害”煙草品種的選育，這對提高卷煙制品的安全性具有重要意義。

煙草煙氣中包含的有害成分可通過肺組織進入循環(huán)系統(tǒng)，從而影響多組織器官[7]，引起水腫、壞死、凋亡等多種類型的細胞損傷[8-10]。細胞凋亡是一種受嚴格調(diào)控的細胞死亡方式[11]，Bcl-2蛋白家族成員Bcl-2與Bax是其重要的效應(yīng)蛋白，二者的水平可影響細胞凋亡/抗凋亡的動態(tài)平衡[12]。細胞中的Bcl-2和Bax蛋白主要結(jié)合于線粒體膜表面，影響線粒體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)線粒體依賴性細胞凋亡[13]。近年來，有研究表明，煙草煙氣可影響細胞中Bcl-2家族蛋白的表達[14-15]。

脾臟作為人體最大的外周免疫器官，是淋巴細胞遷移、免疫應(yīng)答以及抗體生成的重要場所[16]。長期吸煙將迫使脾臟反復(fù)接觸血液中的煙草煙氣有害成分，對脾組織造成損傷，引起免疫功能失常，嚴重威脅人體健康。ZHUO等[17]研究表明，煙草煙氣暴露可影響脾組織中細胞凋亡的趨勢，同時暗示這可能與Bcl-2家族蛋白有關(guān)。

本研究以2種基因型的煙草為試驗材料，通過單純?nèi)珶煔獗┞斗▽D大鼠進行染毒，通過檢測大鼠脾組織中Bcl-2和Bax的表達水平，從Bcl-2/Bax值入手分析煙草煙氣暴露對脾組織的影響，評價不同基因型煙草可能的毒理學(xué)效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

雄性SD大鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；供試煙草品種T-1，T-2由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種研究室提供，卷制成單料煙待用。

1.2 試劑

兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體購自Proteintech公司；兔抗大鼠Bax多克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司；SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙氣暴露動物毒理模型構(gòu)建 將24只雄性清潔級SD大鼠隨機分為正?？諝獗┞秾φ战M（CK）和2個煙氣暴露處理組（T-1，T-2），每組 8只。參考文獻[6-8]中的方法，將SD大鼠置于有機玻璃染毒箱中，每次點燃10支香煙，煙霧泵入染毒箱并維持1 h，每天2次，間隔4 h，每周6 d，持續(xù)56 d；對照組正?？諝獗┞?。

1.3.2 脾組織采樣及處理 分別于染毒28，56 d各組隨機取4只大鼠，10 g/L戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。解剖取脾組織，經(jīng)常規(guī)方法制成石蠟包埋組織塊。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測脾組織Bcl-2和Bax的表達 常規(guī)石蠟切片、脫蠟至復(fù)水，SABC三步法檢測Bcl-2和Bax的表達，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后中性樹膠封片鏡檢，100倍放大視野拍照，隨機選取5張通過Image Pro Plus 6.0分析圖像的積分光密度（Integral optical density，IOD），計算平均光密度，分析Bcl-2和Bax蛋白的表達量，進一步分析脾組織中Bcl-2/Bax值。

1.4 統(tǒng)計分析

使用SPSS 18.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以表示，多組間執(zhí)行One-way ANOVA單因素方差分析和Duncan's差異顯著性檢測，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙氣暴露對脾組織Bcl-2和Bax表達的影響

由圖1和表1可知，染毒大鼠脾組織白髓（WP）和紅髓（RP）中的Bcl-2表達水平均明顯上升（P＜0.05），且T-2組WP的Bcl-2水平顯著高于T-1組（P＜0.05）；而在 RP中，染毒28 d時T-2組的表達水平顯著高于T-1組（P＜0.05），但56 d時T-1組的Bcl-2水平顯著高于T-2組（P＜0.05）。由圖2和表1可知，染毒大鼠WP的Bax表達均始終無明顯變化（P＞0.05），T-1與T-2組間也無顯著差異（P＞0.05）；而在 RP中，Bax的表達均明顯增加（P＜0.05），染毒28 d時T-1組顯著高于T-2組（P＜0.05），但56 d時T-1和T-2組間無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，煙草煙氣暴露能刺激大鼠脾組織WP和RP中Bcl-2以及RP中Bax的表達，但對WP中Bax表達無明顯影響。T-1組Bcl-2和Bax表達水平的變化較T-2組更為明顯，說明不同基因型煙草對大鼠脾組織Bcl-2和Bax表達的影響存在明顯差異。

表1 煙氣暴露大鼠脾組織白髓及紅髓中 Bcl-2和Bax的表達水平（n＝4

表1 煙氣暴露大鼠脾組織白髓及紅髓中 Bcl-2和Bax的表達水平（n＝4

注：*表示與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；#表示試驗組間差異顯著（P＜0.05）。表2同。

處理CK T-1 T-2 CK T-1 T-2染毒時間/d 28脾白髓（WP） 脾紅髓（RP）56 Bcl-2 5.41±0.64 7.68±1.32*19.05±2.51*#5.03±0.22 8.96±1.87*13.75±2.1*#Bax 2.98±0.21 3.09±0.58 3.12±0.34 2.94±0.26 3.07±0.11 2.94±0.36 Bcl-2 5.91±1.03 12.42±2.32*23.94±3.82*#5.33±0.44 12.35±2.15*8.53±0.77*#Bax 2.37±0.14 4.85±0.27*3.73±0.26*#2.43±0.23 10.11±0.31*9.38±0.86*

2.2 煙草煙氣暴露對大鼠脾組織中Bcl-2/Bax值 的影響

表2 香煙煙霧暴露大鼠脾組織Bcl-2/Bax值（n＝8

表2 香煙煙霧暴露大鼠脾組織Bcl-2/Bax值（n＝8

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對Bcl-2/Bax值的分析表明，與對照組相比，試驗組大鼠WP中Bcl-2/Bax值均顯著上升（P＜0.05），且T-2組WP的水平顯著高于T-1組（P＜0.05）；雖然在染毒28 d時，T-2組RP的Bcl-2/Bax值明顯上升且顯著高于T-1組（P＜0.05），但染毒結(jié)束后T-1和T-2組均顯著低于對照組（P＜0.05），且 2個組間無顯著差異（P＞0.05）（表 2）。結(jié)果說明，煙氣暴露后脾組織不同結(jié)構(gòu)的Bcl-2/Bax值有明顯差異，同時不同基因型煙草對脾組織Bcl-2/Bax值的影響也具有顯著差異。

3 討論

細胞凋亡是一種調(diào)節(jié)并維持正常細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵效應(yīng)，受抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的調(diào)控，二者可與線粒體膜上的電壓依賴性離子通道相互作用影響細胞色素C依賴性細胞凋亡信號通路[18]，決定下游Caspase-3激活的與否[19-20]。同屬Bcl-2蛋白家族的Bcl-2與Bax在細胞中常以二聚體的形式存在并可相互作用，當Bcl-2與Bax水平處于動態(tài)平衡時，細胞中多為Bcl-2/Bax異源二聚體，二者動態(tài)平衡被打破后，細胞中Bcl-2或Bax同源二聚體增多，增強其抗凋亡或促凋亡作用，影響細胞凋亡趨勢[21-22]。因此，Bcl-2/Bax值能在一定程度上體現(xiàn)細胞中Bcl-2與Bax二聚體的水平，反映細胞凋亡的趨勢。

通過循環(huán)系統(tǒng)進入脾組織的煙草煙氣成分可影響細胞Bcl-2與Bax的表達，破壞Bcl-2與Bax之間的動態(tài)平衡，改變Bcl-2與Bax間相互作用及其同源或異源二聚體的水平，繼而影響脾組織的細胞凋亡[16]。本研究表明，不同基因型煙草煙氣暴露后，大鼠脾組織中Bcl-2和Bax水平發(fā)生不同程度的變化，導(dǎo)致脾組織細胞的Bcl-2/Bax動態(tài)平衡被打破。

NADZRI等[23]和PIEKARSKA等[24]的研究認為，Bcl-2/Bax值的上升可抑制細胞凋亡，導(dǎo)致細胞異常增殖、癌變和慢性炎癥等的發(fā)生；而Bcl-2/Bax值的下降可能使組織細胞凋亡增強，并造成一定的損傷。本研究中，大鼠脾白髓Bcl-2/Bax值顯著升高，表明細胞凋亡受到抑制，這一變化可延長白髓中炎癥細胞的壽命，導(dǎo)致異常炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在MANFREDI等[25]的研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)。而大鼠脾紅髓Bcl-2/Bax值顯著降低，說明煙草煙氣可促進脾紅髓細胞凋亡并導(dǎo)致脾組織損傷。此外，T-1與T-2組大鼠脾組織中Bcl-2和Bax水平以及Bcl-2/Bax值間存在明顯差異，這可能是由于不同基因型煙草間化學(xué)成分不同，繼而對脾組織產(chǎn)生的影響不同。

綜上所述，煙草煙氣可刺激脾白髓細胞上調(diào)Bcl-2/Bax值，與異常炎癥的發(fā)生有關(guān)；而脾紅髓更易因煙草煙氣暴露而發(fā)生細胞凋亡，導(dǎo)致組織損傷。同時煙草基因型不同與脾組織Bcl-2，Bax表達及Bcl-2/Bax值的變化緊密相關(guān)，這可能與不同基因型煙草的化學(xué)成分存在差異有關(guān)。Bcl-2/Bax值一定程度反映了細胞凋亡的趨勢，有可能作為評價煙草體內(nèi)毒理學(xué)效應(yīng)的潛在指標。

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