任曉亮，王冰霜，曹娜娜，陳錦霞，王 坤，趙學濤

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

[作者簡介] 任曉亮，男，博士,研究方向為臨床輸血管理、血液免疫學。

[通信作者] 趙學濤，E-mail: zhaoxuetao7701@163.com

[基金項目] 河北省衛(wèi)計委青年科技課題資助項目(ZD20140268)

異體輸血是惡性腫瘤患者進行根治性手術及術后放、化療的重要支持治療手段，其對于腫瘤患者免疫功能的影響及作用機制也成為醫(yī)學領域研究的熱點。研究表明，異體輸血可導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，促使腫瘤復發(fā)及轉移，增加術后感染率等，對腫瘤患者的特異性及非特異性免疫均有明顯抑制作用[1-2]。輔助性T淋巴細胞17(Th17)和調節(jié)性T細胞(Treg)屬于新型T細胞亞群，在分化發(fā)育和功能發(fā)揮的過程中受到多種細胞因子和轉錄因子的調節(jié)，共同維護機體的免疫平衡。Th17可以促進免疫應答，與其分泌的特異性細胞因子白細胞介素-17(IL-17)形成Th17-IL-17軸，在宿主防御、自身免疫性疾病以及腫瘤中發(fā)揮著重要作用[3]。Treg細胞表達CD4、CD25，特征性地表達叉頭狀轉錄因子3(Foxp3)，抑制免疫應答，在機體對抗腫瘤時發(fā)揮負向調節(jié)作用[4]。Th17、Treg細胞在機體免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要作用[5]，Th17/Treg失衡參與自身免疫、感染、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展[6-9]。本研究通過檢測健康者和胃癌患者輸血前后外周血Th17、Treg細胞比例變化，評估了圍術期輸血對于胃癌患者Th17/Treg失衡的影響，現(xiàn)將結果報道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2015年1月—2016年3月在我院體檢健康者20例作為對照組，男13例，女7例；年齡41～70歲。選擇同期在胃腸外科接受胃癌根治手術患者57例作為胃癌組，男39例，女18例；年齡38～72歲；均經組織病理學證實，術前未接受放、化療治療，均無輸血史，麻醉用藥及手術方法相同，臨床資料完整；排除伴自身免疫性疾病(類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎)、血液及淋巴系統(tǒng)疾病者，近2年內服用過任何免疫調節(jié)藥物者，既往其他惡性腫瘤者，有嚴重心血管基礎疾病者。所有患者簽署知情同意書，本研究已通過河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會審查。根據圍手術期是否輸異體血，將胃癌組患者分為未輸血組26例和輸血組(術中輸注懸浮紅細胞)31例，2組性別、年齡、體質量、血紅蛋白(Hb)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 2組胃癌患者一般臨床指標比較

1.2試劑和儀器 FITC標記鼠抗人CD4抗體、PE 標記鼠抗人IL-17抗體、PE標記鼠抗人CD25抗體、PerCP-Cy5.5標記鼠抗人Foxp3抗體、Thl7破膜劑、FoxP3固定劑和破膜劑、Permeabilization buffer等抗體及試劑均購自eBioseience公司，F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液(天津川頁生化制品有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基等用于流式細胞染色的抗體均購自美國Biolegend公司，PMA、Ionomycin、BFA等檢測試劑均購自Sigma公司。實驗儀器：FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences)、CO2培養(yǎng)箱(TC 2323型，美國Sheldon公司)、24孔細胞培養(yǎng)板(Costar)。

1.3觀察指標 采集對照組和胃癌組術前1 d和術后1 d、7 d、14 d空腹外周靜脈血標本5 mL,3 000 r/min離心10 min后取血清保存。流式細胞術分別檢測并計算Th17、Treg細胞占CD4淋巴細胞比例(分別以其特征性分泌的CD4+IL-17+和CD25+Foxp3+細胞因子所占CD4+T淋巴細胞的百分比表示)。

2 結 果

2.1對照組與胃癌組外周血Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值比較 胃癌組患者外周血中Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值均明顯高于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2 對照組與胃癌組外周血Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.2未輸血組與輸血組術前及術后外周血Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值比較 術后14 d，未輸血組外周血Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值與術前1 d比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；輸血組外周血Th17、Treg細胞比例均明顯高于術前1 d及同期未輸血組(P均<0.05)，而Th17/Treg比值明顯低于術前1 d及同期未輸血組(P均<0.05)。見表3。

3 討 論

異體輸血可能與惡性腫瘤患者的不良預后相關。腫瘤免疫和移植相關醫(yī)學研究表明：異體血中的可溶性白細胞抗原、細胞因子等生物活性成分可能通過抑制免疫效應細胞，同時刺激免疫抑制細胞，對腫瘤患者的特異性及非特異性免疫產生明顯抑制作用，包括降低輔助性T細胞(Th)及自然殺傷細胞(NK)的活性，增加抑制性T細胞(Ts)等[1-2]。異體血中的異型白細胞可直接活化受血者體內的CD4+T細胞，導致細胞因子分泌[10]。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等,可介導與細胞毒和局部炎癥有關的免疫應答；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，主要功能為刺激B 細胞增生并產生抗體，可抑制Th1的功能[11]。輸血引發(fā)的主要免疫學改變?yōu)門h1細胞因子產量降低，Th2細胞因子產量增加[12]。而除Th1、Th2外，初始CD4+T細胞還可分化為Th17和Treg兩種新型T細胞亞群。其分化、發(fā)育調節(jié)機制不同于Th1、Th2，與自身免疫性疾病和感染性疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切[4-5]。Th17細胞主要分泌IL-17，在炎癥、自身免疫性疾病[13]以及移植物抗宿主病[12]等疾病中具有重要的致病作用；Treg特征性表達 Foxp3，可通過分泌IL-4、IL-10和轉化生長因子-β(TGF-β)等細胞因子抑制抗腫瘤免疫應答，不利于腫瘤免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫[7]。Th17細胞和Treg細胞在分化過程中具有高度相關性，在功能上相互拮抗，即TGF-β誘導初始T細胞分化為Treg，而TGF-β和IL-6共同作用下可誘導初始T細胞分化為Th17[6]。

表3 未輸血組與輸血組術前及術后外周血Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值比較

注：①與術前1d比較，P<0.05；②與未輸血組比較，P<0.05。

目前研究表明，胃癌[7-8]、宮頸癌[9]、肺癌[14]、子宮內膜癌[15]等患者的外周血或腫瘤組織中Th17細胞水平明顯升高，提示Th17細胞利于腫瘤的生長；在腫瘤微環(huán)境中，Treg細胞對T細胞免疫應答有很強的免疫抑制活性，對機體抗腫瘤免疫意義重大[16]。Li 等[7]發(fā)現(xiàn)胃癌患者Th17、Treg細胞及Th17/Treg細胞比值明顯增高，并與患者TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤分化程度相關，提示胃癌患者存在Th17/Treg失衡并促進了胃癌的進展。本研究結果顯示，胃癌患者外周血中Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值均明顯高于對照組，與上述結論一致。Maruyama等[17]認為在胃癌早期以Th17細胞增高為主，并隨著腫瘤的進展減少；Treg細胞則隨腫瘤進展顯著增高，提示Treg細胞與胃癌進展相關，在Th17/Treg失衡中占主導地位。Wolf 等[18]在對卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，增多的Treg細胞可導致患者存活率降低。本研究結果顯示，胃癌患者輸血后14 d，Th17、Treg細胞比例均增高，其中Treg細胞比例增高更為顯著，導致Th17/Treg比值明顯降低，加劇Th17/Treg失衡，影響患者的細胞免疫，可能促進胃癌進展并影響預后。

綜上所述，胃癌患者存在Th17/Treg失衡；圍術期異體輸血可能通過調節(jié)Th17、Treg免疫細胞表達導致Th17/Treg失衡加劇，影響胃癌患者的細胞免疫狀態(tài)。故對于惡性腫瘤患者輸血應更加審慎，合理應用血液制品，推廣去白及輻照血液制品[19-20]的使用，對于維持胃癌患者的細胞免疫功能狀態(tài)具有重要意義。本研究未涉及患者腫瘤性質、分期及淋巴結轉移等因素，還有待進一步研究。

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