肖 婷 馬天陽 徐祥清 王克威.2

1. 北京大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，北京，100871，中國

2. 青島大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，青島，266071，中國

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是現(xiàn)代社會常見的精神疾病，主要表現(xiàn)為情緒低落，對任何事情不感興趣，充滿孤獨(dú)感以及具有自殺傾向［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2020年，抑郁癥將成為繼心血管疾病之后影響人們生活質(zhì)量的第二大疾病［2-3］。盡管重度抑郁癥給個人和社會生活帶來了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，針對重度抑郁癥治療的有效措施卻是有限的。究其原因主要是對重度抑郁癥的病生理機(jī)制不甚了解［4］。因此，有必要建立可靠的疾病動物模型，探究重度抑郁癥的病生理過程，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的可干預(yù)的分子靶標(biāo)。

重度抑郁癥動物模型必須滿足三個標(biāo)準(zhǔn)，即癥狀相符（face validity）、致病因素一致（construct validity）和能被抗抑郁藥治療（predictive validity）［5-6］。癥狀相符是指動物模型要與重度抑郁癥患者具有相同的表型，例如食欲不振，體質(zhì)量減輕，快感缺失及社會交往障礙等；致病因素一致是指導(dǎo)致抑郁癥的物理心理因素相同，例如遺傳因素和環(huán)境因素；能被抗抑郁藥治療，是指模型動物的抑郁樣表型能被現(xiàn)階段有效的陽性抗抑郁劑所逆轉(zhuǎn)。目前能滿足這三個標(biāo)準(zhǔn)的有急性抑郁動物模型［7-10］，醫(yī)源性抑郁模型［11-12］以及慢性抑郁動物模型［13-14］。急性抑郁動物模型主要用于抗抑郁化合物的篩選，醫(yī)源性抑郁模型用于研究抑郁癥的激素和免疫系統(tǒng)的變化，而慢性抑郁模型主要用于重度抑郁癥的發(fā)病機(jī)制研究。慢性溫和不可測應(yīng)激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）模型［15-17］和社會挫?。╯ocial defeat，SD）［18-21］模型符合動物模型的三個標(biāo)準(zhǔn)。不同文獻(xiàn)CUMS模型和SD模型的評價(jià)指標(biāo)不一致，且模型重復(fù)性較差［22］，因此，有必要摸索更可靠的造模方法。

在本研究中，針對大鼠CUMS模型，采用簡便的應(yīng)激因子如通宵照明、夾尾和濕籠等進(jìn)行模型的建立，造模后使用禁水20 h，測試24 h的糖水偏愛實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測試。小鼠SD模型連續(xù)10 d應(yīng)激后進(jìn)行社會交往測試，其測試時(shí)間由2.5 min延長為5 min。通過對著兩種模型的建立方法和評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行反復(fù)調(diào)整，以期建立穩(wěn)定及重復(fù)性較好的慢性抑郁模型，并對兩種模型的造模特點(diǎn)及優(yōu)劣勢進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量（180～250） g；C57BL/6J小鼠，♂，體質(zhì)量（20～25） g；CD-1小鼠，♂，7～8月退役種鼠，體質(zhì)量（35～45） g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)在（20±1） ℃環(huán)境中，飼養(yǎng)房間晝夜顛倒，晚上8點(diǎn)開燈，早上8點(diǎn)關(guān)燈。濕度40%～60%，12 h光照/黑暗循環(huán)，水和食物充足，大鼠在尾部用藍(lán)色標(biāo)記筆編號，小鼠用訂制的金屬耳標(biāo)編號。所有涉及本研究動物的研究均遵循2017年新修訂版《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》的指導(dǎo)原則，并已獲得北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理實(shí)驗(yàn)動物委員會的批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氟西汀，購于Sigma公司，其他所用試劑均為國產(chǎn)。氟西?。╢luoxetine）溶液，大鼠腹腔注射用劑量為10 mg·kg-1，稱取相應(yīng)劑量氟西汀粉末溶于相應(yīng)體積注射用生理鹽水中，超聲溶解。配制溶液4 d內(nèi)用完，常溫儲存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

大鼠游泳桶的制作尺寸為內(nèi)徑 25 cm、水深45 cm。實(shí)驗(yàn)所用曠場為定制的不透明塑料箱，其規(guī)格為42 cm（w）×42 cm （d）×42 cm （h）。聯(lián)合開場視頻分析系統(tǒng)（Clever Sys Inc，Leesburg，VA，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型

1.2.1.1 CUMS模型 CUMS造模方法在Willner方法的基礎(chǔ)上加以修改［23］。造模Wistar大鼠連續(xù)28 d暴露于不可預(yù)測的溫和應(yīng)激中，每天隨機(jī)兩種不同的應(yīng)激方式，主要的應(yīng)激因子包括通宵照明、夾尾、濕籠、擁擠、冰水游泳、禁水禁食［24］等。

1.2.1.2 SD模型 SD模型利用同種物種間不同個體的社交沖突來產(chǎn)生情緒上和心理上的刺激，從而造成社交障礙而出現(xiàn)抑郁樣表型。本研究在Golden的基礎(chǔ)上加以修改［20］，選用CD-1雄性小鼠作為攻擊鼠（宿主），選擇C57BL/6J作為實(shí)驗(yàn)鼠（入侵者），利用雄性小鼠的領(lǐng)地意識，當(dāng)有外來小鼠C57BL/6J入侵的時(shí)候，宿主CD-1小鼠便會自發(fā)攻擊入侵小鼠。社會挫敗刺激主要分為兩個階段，第一階段是5～10 min的身體攻擊，實(shí)驗(yàn)鼠C57BL/6J進(jìn)入CD-1的領(lǐng)地，被CD-1連續(xù)攻擊5～10 min；第二階段為 24 h 的感官接觸［25］（Fig.1）。慢性SD模型連續(xù)應(yīng)激10 d，每天進(jìn)行一次社會挫敗刺激。

Fig.1 Schematic diagram of social defeat stressor

1.2.2 行為學(xué)指標(biāo)

1.2.2.1 糖水偏愛測試 糖水偏愛測試前，將Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠單籠飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境2 d，d 1給予Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠兩瓶0.8%的蔗糖水，d 2給予一瓶水和一瓶0.8%糖水，在時(shí)間中間點(diǎn)更換兩瓶位置。測試當(dāng)天，Wistar大鼠或C57BL/6J小鼠禁水20 h，之后給予水和0.8%糖水各一瓶，使Wistar大鼠或C57BL/6J小鼠自由飲水24 h，時(shí)間中間點(diǎn)更換兩瓶位置。造模前先進(jìn)行糖基線的測試，造模后不再適應(yīng)環(huán)境直接禁水20 h，測試24 h評估造模是否成功。24 h后統(tǒng)計(jì)Wistar大鼠或C57BL/6J小鼠飲水情況。計(jì)算糖水偏愛率（sucrose preference），取平均值。糖水偏愛率計(jì)算公式為［26］：

1.2.2.2 強(qiáng)迫游泳測試 強(qiáng)迫游泳測試（forced swimming test，F(xiàn)ST）在 Porsolt的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)［27］。強(qiáng)迫游泳屬于抑郁癥的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，對大、小鼠皆適用，主要用來考察動物的行為絕望［28］。Wistar大鼠游泳桶尺寸為內(nèi)徑25 cm、水深45 cm。將動物放于水中游泳6 min，實(shí)驗(yàn)者對后4 min中Wistar大鼠在水中的不動時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不動的標(biāo)準(zhǔn)為Wistar大鼠只將頭部露出水面漂浮于水面，身體不掙扎，不動時(shí)間越長，表明動物越絕望。實(shí)驗(yàn)過程中，Wistar大鼠要彼此分開，免受視聽干擾。要求每次放下一只Wistar大鼠之前，要將水面上漂浮的糞便清理干凈，從水中撈起Wistar大鼠后，用毛巾盡可能將其毛發(fā)擦干，以防感冒。

1.2.2.3 社會交往測試 社會交往測試（social interaction test，SIT）用以評價(jià)社會挫敗模型小鼠的社會交往能力。實(shí)驗(yàn)所用曠場為定制的不透明塑料箱（Fig.2），其規(guī)格為42 cm （w）×42 cm （d）×42 cm （h）。曠場分為兩個區(qū)，一是圍繞金屬籠周邊14 cm （w）×24 cm （d）的接觸區(qū)（interaction zone），另一個是與接觸區(qū)相對應(yīng)的兩個9 cm （w）×9 cm （d）的角落區(qū)（corner zone）［20］。測試分為兩個階段，第一階段為無攻擊鼠階段（target absent），此時(shí)接觸區(qū)中放一個空的金屬籠子，將C57BL/6J小鼠頭朝角落區(qū)方向放于曠場最中間，然后錄像記錄5 min的活動情況；第二階段為有攻擊鼠階段（target present），此時(shí)在接觸區(qū)中換一個同樣的新金屬籠子，并且在金屬籠內(nèi)放上一只陌生的CD-1攻擊鼠，然后將C57BL/6J小鼠頭朝角落區(qū)放于曠場最中間，錄像記錄5 min的活動情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用視頻分析系統(tǒng)分析300 s小鼠在曠場各個區(qū)的活動時(shí)間。社會交往率（social interaction ratio，SIR） =有攻擊鼠存在時(shí)C57BL/6J小鼠在接觸區(qū)持續(xù)時(shí)間/無攻擊鼠存在時(shí)C57BL/6J小鼠在接觸區(qū)持續(xù)時(shí)間。SIR≥1，表明C57BL/6J小鼠是抵抗鼠（resilient），對此應(yīng)激不敏感；SIR＜1，表明 C57BL/6J小鼠是易感小鼠（susceptible），即為造模成功小鼠。實(shí)驗(yàn)中要保持絕對安靜，且每階段放C57BL/6J小鼠進(jìn)曠場前，都要將糞便處理干凈并噴灑75%的酒精去除異味，以免對測試造成干擾。

Fig.2 Schematic diagram of social interaction test （SIT）

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CUMS使Wistar大鼠糖水偏愛率顯著降低而使強(qiáng)迫游泳的不動時(shí)間顯著延長

經(jīng)過28 d應(yīng)激，成功建立Wistar大鼠CUMS模型。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠分為空白對照組（control），模型組（CUMS）和氟西汀陽性藥組（CUMS + Flu）。造模前，按照糖水偏好率基礎(chǔ)值和體質(zhì)量平均分組，各組糖水偏愛率約80%，體質(zhì)量為233 g左右。4周造模后，模型組糖水偏愛率降低為69.3%，顯著低于空白對照組的81.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；氟西汀陽性藥組糖水偏愛率為82.1%，表明氟西汀能夠使糖水偏愛率恢復(fù)（Fig.3C）。從造模第一周開始，CUMS模型組組和氟西汀陽性藥組的體質(zhì)量顯著低于對照組（P＜0.001），且這種趨勢一直持續(xù)到第4周（Fig.3B）。4周造模后，對大鼠進(jìn)行FST行為學(xué)測試，CUMS模型組不動時(shí)間為131.2 s，空白對照組不動時(shí)間為105.1 s，其不動時(shí)間明顯高于空白對照組（Fig.3D）（P＜0.05），CUMS 模型組大鼠表現(xiàn)為行為絕望。氟西汀陽性藥組不動時(shí)間為108.3 s，與空白對照組相比沒有差異，表明不動時(shí)間延長趨勢能夠被陽性藥氟西汀所逆轉(zhuǎn)。CUMS應(yīng)激使Wistar大鼠糖水偏愛率顯著降低，體質(zhì)量減低且FST的不動時(shí)間顯著延長，符合抑郁癥表型，認(rèn)為此次模型成功（Fig.3）。

Fig.3 Behavior evaluations of CUMS in rats

2.2 慢性SD應(yīng)激使C57BL/6J小鼠產(chǎn)生社交障礙并降低糖水偏愛率

Fig.4 Behavior evaluations of social defeat in C57BL/6J mice

SD模型時(shí)間流程如Fig.4A所示，C57BL/6J小鼠作為入侵者被CD-1宿主小鼠連續(xù)攻擊10 d，每天的社會挫敗刺激均為5～10 min的身體攻擊和24 h的感官接觸（Fig.1）。造模后，將社會交往率小于1的成為敏感鼠（susceptible），大于 1 的成為抵抗鼠（resilient）［20］，將敏感鼠作為SD模型成功組，以下數(shù)據(jù)將模型組（social defeat susceptible）和空白對照組（control）進(jìn)行評估。造模前，對照組和SD敏感小鼠組的糖水偏愛率分別為82.7%和81.7%，經(jīng)過連續(xù)10 d的應(yīng)激，對照組和SD敏感小鼠組的糖水偏愛率分別為78.6%和69.2%，SD敏感小鼠組小鼠的糖水偏愛率相比對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（Fig.4B）。在SIT行為學(xué)測試中，當(dāng)曠場中無攻擊鼠時(shí)，SD敏感組小鼠在接觸區(qū)和角落區(qū)與對照組相比沒有差異（Fig.4D，4E）；而當(dāng)有攻擊鼠存在時(shí)，與對照組小鼠比較，SD敏感組小鼠在角落區(qū)待的時(shí)間顯著增加（Fig.4E），在接觸區(qū)停留時(shí)間顯著減少（Fig.4D），并且 SIR 小于 1（Fig.4C），證明經(jīng)過應(yīng)激的SD敏感小鼠產(chǎn)生了社交障礙，致使其減少在接觸區(qū)與CD-1小鼠的互動。SD敏感小鼠與對照小鼠的總運(yùn)動路程沒有差異（Fig.4F），這表明小鼠經(jīng)過社會擊敗應(yīng)激后自發(fā)活動不受影響，小鼠運(yùn)動能力正常。根據(jù)以上結(jié)果，認(rèn)為此次社會挫敗小鼠造模成功。

3 討論

盡管沒有動物模型真正能夠反映抑郁癥病人的癥狀，但是建立嚙齒類動物抑郁癥模型仍然非常必要。關(guān)于建立CUMS大鼠模型，每天采用兩種不同的應(yīng)激因素對大鼠進(jìn)行刺激，在糖水偏愛測試過程中發(fā)現(xiàn)，前幾次都采用禁水24 h，測試1 h，這種測試方式會使禁水大鼠因?yàn)榭诳识x擇就近原則，不一定表現(xiàn)出偏愛糖水行為，所以之后將糖水測試時(shí)間改為禁水20 h，測試24 h，以保證大鼠有足夠的時(shí)間去選擇水或者糖水。

總結(jié)三次大鼠CUMS的造模過程，可以得出以下結(jié)論：①糖水測試次數(shù)要少，以免形成記憶；②從數(shù)據(jù)上分析，似乎糖水基礎(chǔ)值大的大鼠比較容易受應(yīng)激的影響而成模；③由于應(yīng)激使大鼠體質(zhì)量下降的較多，在做實(shí)驗(yàn)時(shí)最好選擇體質(zhì)量大一點(diǎn)的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

社會挫敗模型是另一常用的慢性抑郁模型。在社會挫敗模型中，SIR小于1成為敏感鼠，大于1則成為抵抗鼠［20］，這種分類方式能夠減少因個體差異性引起整體動物行為學(xué)的評估情況（例如CUMS中因個體天生不喜愛喝糖水而影響整體糖水偏愛率評估）。模型一開始采用10 min的身體攻擊時(shí)間，發(fā)現(xiàn)CD-1退役種鼠攻擊力太強(qiáng)，C57BL/6J小鼠受外傷嚴(yán)重，因此后期身體攻擊時(shí)間改為5 min，感官接觸時(shí)間仍然為24 h。連續(xù)10 d的社會挫敗應(yīng)激，每天都會有C57BL/6J小鼠死亡，為了保證造模結(jié)束有足夠量的樣本，建議在實(shí)驗(yàn)開始前每組至少20只。

重度抑郁癥是多向性疾病，它是由多種因素導(dǎo)致的疾病且具有多種抑郁樣表型［29-31］。比較兩種慢性抑郁模型CUMS模型和SD模型，CUMS模型模擬人類所受社會生活和環(huán)境等多種因素的影響，能較真實(shí)反映重度抑郁癥的病理發(fā)生發(fā)展，因此，常用作重度抑郁癥的機(jī)制研究。SD模型應(yīng)激因素相對比較單一，但其能模擬人類重度抑郁癥致病最重要的因素，因此也常用作機(jī)制研究［25］。此外從本研究可以看出，CUMS模型實(shí)驗(yàn)周期較長（至少4周），而社會挫敗模型實(shí)驗(yàn)周期較短（僅為10 d），實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較高，并且其行為學(xué)指標(biāo)除了糖水偏愛率，還增加了社會交往率，多種行為學(xué)指標(biāo)的統(tǒng)一更能增加模型可信性。此外文獻(xiàn)報(bào)道稱［20］，社會挫敗應(yīng)激的影響可以持續(xù)一個月，因此篩選抗抑郁劑和評估陽性藥引起生理變化時(shí)，可以在10 d模型后連續(xù)給藥觀察，這樣不會因造模過程中給藥帶來的外傷刺激影響模型的成敗。

CUMS模型和SD模型能使大小鼠糖水偏愛率顯著降低而引起快感缺失等抑郁樣表型，因此都常用作重度抑郁癥的疾病機(jī)制研究。本研究通過比較，認(rèn)為小鼠社會挫敗抑郁模型因其實(shí)驗(yàn)周期較短，穩(wěn)定性和可重復(fù)性較高等優(yōu)勢，推薦在未來的重度抑郁癥研究中首選作為其機(jī)制和抗抑郁劑篩選的動物模型。

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