唐旗羚 曹穎男 徐娟娟 王有娣 賀 彥 鄭江洋 溫梓媚 張素中*

（中山大學(xué)新華學(xué)院，廣東 廣州 510520）

腫瘤是機(jī)體局部組織細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成。現(xiàn)有化療藥物雖然抗癌作用確切，療效顯著，但也存在嚴(yán)重不良反應(yīng)、長期應(yīng)用易產(chǎn)生腫瘤多重耐藥性的缺陷。而中藥復(fù)方可以免疫調(diào)節(jié)為基礎(chǔ)，逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫逃逸，改善機(jī)體功能，抑制腫瘤生長。已有研究表明雞血藤、柴胡、蜈蚣、半夏等中藥材能夠明顯抑制肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤組織生長，其中蜈蚣提取物可顯著阻滯宮頸癌細(xì)胞周期[1-7]，厚樸酚對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用[8]。本文基于已有研究將雞血藤、厚樸、柴胡、生半夏、蜈蚣進(jìn)行組方并提取，探索該組方提取物的抗腫瘤作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步研究，為后續(xù)藥理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人肝癌HepG2細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞、骨肉瘤143B細(xì)胞、急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞。

1.1.2 儀器與試劑：CCK-8試劑、二甲基亞砜、RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、倒置熒光顯微鏡、Hoechst 33258熒光染色檢測(cè)試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法測(cè)定雞血藤組方提取物對(duì)各腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響：收集對(duì)數(shù)生長期的HepG2、A549、143B、CNE-2Z、HL-60細(xì)胞，接種于96孔板，每孔加90 μL的細(xì)胞懸液，在37 ℃條件下孵育。每孔對(duì)應(yīng)加入0.0044～17.00 mg/mL不同梯度濃度的雞血藤組方提取物10 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育72 h，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值。采用Graph Pad Prism 5軟件分析雞血藤組方提取物在72 h的IC50值并作圖。腫瘤細(xì)胞生長抑制率%＝[（受試物吸光度值-陰性對(duì)照吸光度值）/（陰性對(duì)照吸光度值-空白對(duì)照吸光度值）]×100%。

1.2.2 Hoechst33258染色法觀察HepG2細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化：取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以每孔500 μL的體積接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后加入0.459 mg/mL濃度的雞血藤組方提取物，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h，4%的多聚甲醛液固定。PBS洗滌。加入Hoechest 33258染色液500 μL，室溫避光染色后PBS洗滌，避光風(fēng)干，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1 雞血藤組方提取物對(duì)各腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響：CCK-8法測(cè)定結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，經(jīng)各濃度雞血藤組方提取物作用后的肝癌HepG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞、骨肉瘤143B細(xì)胞、急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞，其增殖均受到不同程度的抑制，并且雞血藤組方提取物對(duì)上述5種細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，見圖1。經(jīng)Graphpad Prism 5軟件分析，雞血藤組方提取物干預(yù)HepG2、A549、CNE-2Z、143B、HL-60細(xì)胞72 h的IC50值分別為0.54、10.04、1.59、0.86、3.37mg/mL，最大抑制率分別為92.06%、98.74%、99.99%、97.44%、77.78%，見表1。

2.2 雞血藤組方提取物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化的影響：Hoechst 33258細(xì)胞核染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞多數(shù)呈現(xiàn)染色質(zhì)均勻分布等活細(xì)胞特征。與空白對(duì)照組相比，雞血藤組方提取物作用48 h的HepG2細(xì)胞，其凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，呈現(xiàn)染色質(zhì)凝集、核濃染等典型特征，提示雞血藤組方提取物可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，見圖2。

圖1 雞血藤組方提取物對(duì)各腫瘤細(xì)胞株增殖抑制作用的IC50值

表1 不同濃度雞血藤組方提取物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的影響

圖2 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化

3 討 論

在腫瘤的中醫(yī)治療中，常用的治療法有扶正培本法、清熱解毒法、活血化瘀法、利濕逐水法、軟堅(jiān)散結(jié)法等[9]。本文雞血藤、厚樸、柴胡、生半夏、蜈蚣組方中藥材具有疏肝理氣、解毒散結(jié)作用而產(chǎn)生扶正抗癌作用，研究結(jié)果表明該組方提取物在體外對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞 、肺癌A549細(xì)胞、鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞、骨肉瘤143B細(xì)胞以及急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞均產(chǎn)生具有濃度依賴性的抑制增殖作用，Hoechst 33258染色結(jié)果提示這可能與該組方提取物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。已有研究表明，中草藥及中藥復(fù)方通過調(diào)控多重藥耐藥基因蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生有效逆轉(zhuǎn)腫瘤多重耐藥的作用，可開發(fā)為腫瘤多重耐藥基因MDR的逆轉(zhuǎn)劑，現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)[10]。李冬梅[11]的研究顯示，扶正解毒中藥復(fù)方可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的基因表達(dá)，改善患者免疫功能，提高化療療效。P-糖蛋白是多重耐藥基因MDR1的蛋白產(chǎn)物，通過消耗ATP將藥物從腫瘤細(xì)胞外排，減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的腫瘤多藥耐藥。基于本文已研究雞血藤組方的抗腫瘤作用及機(jī)制，可進(jìn)一步研究其對(duì)MDR基因及其相關(guān)蛋白產(chǎn)物表達(dá)的影響，以期為中藥組方在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮重要作用提供理論基礎(chǔ)。

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