吳新輝，周燁鑫，成克用，吳潤(rùn)秋

(長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219)

幽門螺旋桿菌(Hp)是定植于胃腸道黏膜的螺旋狀、微需氧革蘭氏陰性桿菌，Hp感染是造成慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等上消化道疾病的重要病因[1-2]。消化道黏膜局部的Hp能夠通過(guò)模式識(shí)別受體TLR2、TLR4來(lái)激活炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成消化道黏膜損傷。此外，長(zhǎng)期Hp感染還會(huì)造成原癌基因激活、增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，根除Hp是預(yù)防和治療多種上消化道疾病的關(guān)鍵。半夏瀉心湯出自張仲景的《傷寒論》，是治療“心下痞”的代表性中藥方劑，被證實(shí)能夠在消化性潰瘍的治療中取得積極治療效果[4]。該方劑包含具有清熱解毒作用的組分和具有扶正補(bǔ)益作用的組分，關(guān)于不同組分對(duì)幽門螺桿菌的根除作用尚未明確,因此在下列研究中，我們具體分析了半夏瀉心湯全方及不同組分治療幽門螺桿菌感染小鼠的療效及分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇C57小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，均為雄性，6～8周齡,體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于湖南動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK 20120005。

半夏瀉心湯全方由生半夏、黃芩、黃蓮、干姜、人參、大棗、甘草組成，清熱解毒組分由黃芩、黃連組成，扶正補(bǔ)益組分由人參、大棗組成，藥劑科按常規(guī)煎煮,濃縮為1 g/ml的溶液。

幽門螺旋桿菌SS1(ATCC公司)；RIPA蛋白裂解液和BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Hp培養(yǎng)及菌液制備方法

將SS1幽門螺旋桿菌在含有8%脫纖維羊血清的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中復(fù)蘇，在15% CO2、5%O2、80%NO2的微需氧環(huán)境下培養(yǎng)48～72 h，陽(yáng)性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)快速尿素酶鑒定后用布氏肉湯收集SS1幽門螺旋桿菌并調(diào)節(jié)密度至109CFU/ml，備用。

1.2.2 動(dòng)物分組及造模方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)A組、干預(yù)B組、干預(yù)C組。模型組及3組干預(yù)組均按下列方法建立幽門螺旋桿菌感染的動(dòng)物模型：禁食24 h后給予5%碳酸氫鈉溶液灌胃，30 min后給予含有109CFU/ml SS1幽門螺旋桿菌的菌液0.2 ml灌胃，連續(xù)灌胃4次、每次間隔48 h。對(duì)照組每次給予等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3 藥物干預(yù)方法

干預(yù)A組給予半夏瀉心湯全方進(jìn)行干預(yù)，用全方原藥材濃度為1 g/mL的藥液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,連續(xù)8天。干預(yù)B組給予半夏瀉心湯清熱解毒組分(黃芩、黃連)進(jìn)行干預(yù)，用黃芩、黃連原藥材濃度為1 g/mL的藥液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,連續(xù)8天。干預(yù)C組給予半夏瀉心湯扶正補(bǔ)益組分(人參、大棗)進(jìn)行干預(yù)，用人參、大棗原藥材濃度為1 g/mL的藥液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,連續(xù)8天。模型組用0.2 ml的生理鹽水灌胃。

1.2.4 幽門螺旋桿菌根除評(píng)估方法

干預(yù)8天后，處死5組小鼠，取胃組織并沿胃大彎剪開(kāi)，DEPC水沖洗胃內(nèi)容物后取一半胃黏膜組織，分別進(jìn)行快速尿素酶(RUT)試驗(yàn)和W-S染色，RUT試驗(yàn)和W-S染色均為陰性的樣本為幽門螺旋桿菌陰性,判定幽門螺旋桿菌根除。

1.2.5 胃黏膜內(nèi)炎癥反應(yīng)程度評(píng)估方法

取DEPC水沖洗后的另一半胃黏膜組織，加入RIPA裂解液后充分勻漿，提取組織中的蛋白質(zhì)，采用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定TLR2、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的含量，計(jì)算每毫克總蛋白中TLR2、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 幽門螺旋桿菌根除情況

模型組幽門螺旋桿菌的感染率為100%、根除率0%；干預(yù)A組幽門螺旋桿菌治療后的感染率為25.0%(2/8)、根除率75.0%；干預(yù)B組幽門螺旋桿菌治療后的感染率為62.5%(5/8)、根除率37.5%；干預(yù)C組幽門螺旋桿菌治療后的感染率為75.0%(6/8)、根除率25.0%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，干預(yù)A組、干預(yù)B組、干預(yù)C組的幽門螺旋桿菌根除率均高于模型組(P<0.05)，干預(yù)A組的幽門螺旋桿菌根除率高于干預(yù)B組和干預(yù)C組(P<0.05)，干預(yù)B組與干預(yù)C組間幽門螺旋桿菌的根除率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.2 胃黏膜中TLRs/NF-κB通路表達(dá)量的比較

模型組小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，干預(yù)B組和C組、干預(yù)B組、干預(yù)C組小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)，干預(yù)A組小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達(dá)量顯著高于干預(yù)A組(P<0.05)，干預(yù)B組與干預(yù)C組間胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達(dá)量比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。具體情況見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠胃黏膜中TLRs/NF-κB通路表達(dá)量的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，&P<0.05；與干預(yù)A組比較，aP<0.05

2.3 炎癥介質(zhì)表達(dá)量的比較

模型組小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，干預(yù)A組、干預(yù)B組、干預(yù)C組小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)，干預(yù)B組和C組小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)量顯著高于干預(yù)A組(P<0.05)，干預(yù)B組與干預(yù)C組間胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)量比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。具體情況見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠胃黏膜中炎癥介質(zhì)表達(dá)量的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，&P<0.05；與干預(yù)A組比較，aP<0.05

3 討論

幽門螺旋桿菌(Hp)感染是引起慢性胃炎、消化性潰瘍等慢性上消化道疾病的主要致病因素，Hp長(zhǎng)期未能根除會(huì)誘導(dǎo)胃黏膜萎縮以及腸上皮化生，進(jìn)而增加胃癌、胃相關(guān)惡性淋巴瘤等惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。因此，根除Hp是治療和預(yù)防多種上消化道疾病的有效手段。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，Hp感染能夠引起寒熱錯(cuò)雜、胃熱脾寒，清熱解毒、扶正補(bǔ)益是中醫(yī)根除Hp感染的常規(guī)思路。已有臨床研究表明，半夏瀉心湯治療Hp陽(yáng)性的消化性潰瘍能夠取得確切療效[7]；相關(guān)基礎(chǔ)研究證實(shí)，半夏瀉心湯的含藥血清能夠有效抑制Hp的體外繁殖[8]。在本研究中，為了明確半夏瀉心湯對(duì)Hp在體繁殖的影響，我們對(duì)半夏瀉心湯全方及各組分干預(yù)后的Hp清除率進(jìn)行了分析，半夏瀉心湯全方干預(yù)后的Hp清除率達(dá)到75.0%，而熱解毒組分及扶正補(bǔ)益組分干預(yù)后的Hp清除率達(dá)到37.5%和25.0%。這就說(shuō)明半夏瀉心湯全方及各組分均具有一定的Hp清除作用，半夏瀉心湯全方對(duì)Hp的清除價(jià)值優(yōu)于清熱解毒組分及扶正補(bǔ)益組分干預(yù)。由此也提示，半夏瀉心湯對(duì)Hp的清除作用依賴于各種藥物成分的配伍，單獨(dú)使用各組分無(wú)法達(dá)到半夏瀉心湯全方的藥理價(jià)值。

Toll樣受體(TLRs)是體內(nèi)重要的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別多種病原模式分子并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9-10]。在Hp的感染過(guò)程中，TLRs中的TLR2和TLR4能夠識(shí)別局部胃黏膜中的Hp，進(jìn)而通過(guò)下游MyD88、IRAK、TRAF6等接頭分子來(lái)激活NF-κB，激活后的NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)、激活胃黏膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)[11-12]。本研究證實(shí)，模型組小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,說(shuō)明幽門螺旋桿菌作為一種病原模式分子，能夠顯著激活TLR2、TLR4，進(jìn)而增加核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)。進(jìn)一步分析半夏瀉心湯對(duì)幽門螺旋桿菌感染過(guò)程中TLRs/NF-κB通路的影響,可知經(jīng)過(guò)半夏瀉心湯全方及各組分干預(yù)后，小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達(dá)量顯著低于模型組，且半夏瀉心湯全方干預(yù)后，小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達(dá)量顯著低于各組分的干預(yù)。由此說(shuō)明半夏瀉心湯全方及清熱解毒組分、扶正補(bǔ)益組分均能顯著抑制幽門螺旋桿菌感染過(guò)程中TLRs/NF-κB通路的激活，且半夏瀉心湯全方干預(yù)對(duì)TLRs/NF-κB通路的抑制效應(yīng)優(yōu)于單獨(dú)使用清熱解毒組分及扶正補(bǔ)益組分進(jìn)行干預(yù)。

TLR2和TLR4激活所介導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位入核能夠啟動(dòng)TNF-α、IL-6、IL-8等多種炎性因子的表達(dá)[13]。TNF-α是在炎癥反應(yīng)啟動(dòng)過(guò)程中最先發(fā)生改變的細(xì)胞因子，不僅能夠直接造成局部組織發(fā)生炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)炎癥性損傷，還能促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞在病灶內(nèi)浸潤(rùn)、放大炎癥反應(yīng)[14]。IL-6是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。IL-8是重要的內(nèi)源性趨化因子，能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在病灶內(nèi)的遷移和浸潤(rùn)，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)[16]。本研究對(duì)胃黏膜中上述炎癥介質(zhì)表達(dá)量的分析證實(shí),模型組小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。這就說(shuō)明幽門螺旋桿菌感染過(guò)程中，TLRs/NF-κB通路的激活能夠顯著增加炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)。進(jìn)一步分析半夏瀉心湯對(duì)幽門螺旋桿菌感染過(guò)程中TLRs/NF-κB通路下游炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響可知,半夏瀉心湯全方及各組分干預(yù)后，小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)量顯著低于模型組,且半夏瀉心湯全方干預(yù)后，小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)量顯著低于各組分的干預(yù)。由此說(shuō)明半夏瀉心湯全方及清熱解毒組分、扶正補(bǔ)益組分均能顯著抑制幽門螺旋桿菌感染過(guò)程中TNF-α、IL-6、IL-8的分泌，且半夏瀉心湯全方干預(yù)對(duì)TNF-α、IL-6、IL-8分泌和表達(dá)的抑制效應(yīng)優(yōu)于單獨(dú)使用清熱解毒組分及扶正補(bǔ)益組分進(jìn)行干預(yù)。

綜上所述，半夏瀉心湯全方及各組分均能根除Hp并抑制TLRs/NF-κB信號(hào)通路，且全方的療效優(yōu)于各組分；在臨床實(shí)踐中應(yīng)用半夏瀉心湯全方治療Hp感染能夠取得積極臨床療效。

[1] YANG Y J,BANG C S,SHIN S P,et al.Clinical characteristics of peptic ulcer perforation in Korea[J].World J Gastroenterol,2017,23(14):2566-2574.

[2] POSSELT G,CRABTREE J E,WESSLER S.Proteolysis in Helicobacter pylori-Induced Gastric Cancer[J].Toxins,2017,9(4):E134.

[3] HATAKEYAMA M.Structure and function of Helicobacter pylori CagA, the first-identified bacterial protein involved in human cancer[J].ProcJpnAcadSer B PhysBiolSci,2017,93(4):196-219.

[4] 彭國(guó)強(qiáng),商建飛,杜杰,等.半夏瀉心湯加減治療Hp相關(guān)消化性潰瘍的臨床分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2016,22(5):197-201.

[5] ABDI E,LATIFI-NAVID S,ZAHRI S,et al.Helicobacter pylori genotypes determine risk of non-cardia gastric cancer and intestinal- or diffuse-type GC in Ardabil: A very high-risk area in Northwestern Iran[J].Microb Pathog,2017,5(107):287-292.

[6] MIFTAHUSSURUR M, YAMAOKA Y, GRAHAM D Y.Helicobacter pylori as an oncogenic pathogen, revisited[J].Expert Rev Mol Med,2017,21(19):e4.

[7] 趙長(zhǎng)城.半夏瀉心湯聯(lián)合西醫(yī)三聯(lián)療法治療慢性胃炎臨床觀察[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,17(5):75-77.

[8] 楊貴珍,鄭月娟,姜昕,等.半夏瀉心湯調(diào)控巨噬細(xì)胞分泌HSP70抗Hp性胃炎作用機(jī)制研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2016,24(1):1-5.

[9] LI S,CAO M,SONG L,et al.The contribution of toll-like receptor 2 on Helicobacter pylori activation of the nuclear factor-kappa B signaling pathway in gastric epithelial cells[J].MicrobPathog,2016,98:63-68.

[10] KOCK K N,MULLER A.Helicobacter pylori activates the TLR2/NLRP3/caspase-1/IL-18 axis to induce regulatory T-cells, establish persistent infection and promote tolerance to allergens[J].Gut Microbes, 2015,6(6):382-387.

[11] GONG Y,TAO L,JING L,et al.Association of TLR4 and Treg in Helicobacter pylori Colonization and Inflammation in Mice[J].PLoS One,2016,11(2):e0149629.

[12] CADAMURO A C,ROSSI A F,Matos Biselli-Périco J,et al.Effect of Helicobacter pylori eradication on TLR2 and TLR4 expression in patients with gastric lesions[J].Mediators Inflamm,2015,2015:481972.

[13] ZHANG X Y,ZHANG P Y,ABOUL-SOUD M.From inflammation to gastric cancer: Role of Helicobacterpylori(Review)[J].Oncology Letters,2017,13(2):543-548.

[14] CHEN G,TANG N,WANG C,et al.TNF-α-inducing protein of Helicobacter pylori induces epithelial-mesenchymal transition (EMT) in gastric cancer cells through activation of IL-6/STAT3 signaling pathway[J].BiochemBiophys Res Commun,2017,484(2):311-317.

[15] PIAO J Y,LEE H G,KIM S J,et al.Helicobacter pylori Activates IL-6-STAT3 Signaling in Human Gastric Cancer Cells: Potential Roles for Reactive Oxygen Species[J].Helicobacter,2016,21(5):405-416.

[16] JANG S,KIM J,CHA J H.Cot kinase plays a critical role in Helicobacter pylori-induced IL-8 expression[J].J Microbiol,2017,55(4):311-317.