張宇馳，闞玉娜，韓東衛(wèi)，葛鵬玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病是一種多病因的代謝類疾病，多由胰島素分泌不足或分泌充足但在代謝作用過程中受阻所致，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)為糖尿病中最常見的類型[1]。胰島素作用缺陷會引發(fā)2型糖尿病胰島素抵抗(insulin resistance,IR)，機(jī)體組織以及靶器官降低了對胰島素生物效應(yīng)的敏感性，致使胰島素對葡萄糖的利用率以及攝取量明顯減少，從而導(dǎo)致機(jī)體中代償性胰島素分泌增加，為維持機(jī)體血糖的平衡，高胰島素血癥得以生成[2]。胰島素抵抗在T2DM的前期及疾病的發(fā)展過程中均有存在[3]。

LEECH C A等[4]通過敲除小鼠鈣敏感受體，發(fā)現(xiàn)鈣敏感受體可能具有調(diào)節(jié)糖誘導(dǎo)胰島素分泌功能，并通過調(diào)節(jié)某種氨基酸從而提高胰島素對葡萄糖靈敏性。AKT是磷脂肌醇3激酶直接目的靶基因，通常情況下將其磷酸化水平作為衡量PI3K活性變化的指標(biāo)[5]，因此PI3K-AKT已經(jīng)成為一種胰島素抵抗分子機(jī)制研究的信號通路。PI3K抑制劑能夠抑制AKT活性，其中的生長因子與胰島素可通過磷酸化作用提高AKT的活性，并引發(fā)磷酸化級聯(lián)反應(yīng)與靶蛋白的相互作用，調(diào)控基因組轉(zhuǎn)錄、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動與生物學(xué)效應(yīng)[6]。LI H X等[7]在鈣敏感受體影響血管平滑肌產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的研究中發(fā)現(xiàn)，鈣敏感受體拮抗劑抑制AKT的活性，同時發(fā)現(xiàn)鈣敏感受體的作用與PI3K-AKT信號通路有關(guān)。因此，鈣敏感受體的表達(dá)或功能異?？赡苁且l(fā)胰島素抵抗的內(nèi)在因素。

當(dāng)前的醫(yī)學(xué)研究中有效治療2型糖尿病胰島素抵抗的藥物尚不明確。中醫(yī)藥于治療糖尿病方面有著特殊的療效，可改善患者病情，減輕西藥的不良反應(yīng)?；ㄆ鞚扇首鳛橐环N治療脾虛濕盛、濕熱內(nèi)蘊(yùn)型2型糖尿病及相關(guān)疾病的經(jīng)驗方，在治療和控制2型糖尿病方面具有確切的療效[8]。本文采用Western blot及qRT-PCR測試技術(shù)，檢測大鼠胰腺組織中的磷酸化AKT蛋白、CaSR mRNA和CaSR蛋白的表達(dá)水平，探究了花旗澤仁對2型糖尿病胰島素抵抗的作用及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠50只，雄性，體質(zhì)量(190～210)g，SPF級，合格證號：SCXK(黑)2013-004，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。大鼠置于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室動物房內(nèi)飼養(yǎng)，溫度(25±2)℃，濕度(55±10)%，大鼠SPF級飼料由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 藥物及試劑

花旗澤仁復(fù)方，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中草藥局提供。鏈脲佐菌素(STZ,BIOSHARP公司。硫氧嘧啶(國藥準(zhǔn)字H32020795)，50 mg×100片，購于精華制藥集團(tuán)股份有限公司，批號31131202；諾和靈R生物合成人胰島素，10 ml×1支，國藥準(zhǔn)字J20070043，丹麥諾和諾德公司，批號BVG0363。

ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRIzol Reagen(福建領(lǐng)江生物科技有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號20131018,北京Solarbio公司)；全活力型血糖試紙(Roche公司，批號23461532)。

DEPC焦炭酸二乙酯(北京中生瑞泰科技有限公司)；AccuPower RocketScript RT PreMix、AccuPower GreenStar qPCR PreMix(柏業(yè)貿(mào)易有限公司公司)；RNase-free water (去離子水加入0.01%的DEPC，上海亞培生物科技有限公司)；丙烯酰胺、10%十二烷基硫酸鈉、甲醇(Micklin公司)；N,N,N′,N′-四甲基二乙胺、10%過硫酸銨(上海亞培生物科技有限公司)；蛋白預(yù)染Marker(Fermentas公司)；CaSR一抗(小鼠)、AKT,T308,S473一抗(兔)、β-actin(兔)均購于abcam公司；二抗購于北京中杉金橋公司。

1.3 儀器

Bio-RAD梯度單頭PCR儀(型號：S1000);Bio-RAD Real-time PCR儀(型號：CFX96)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士帝肯)；Mircro 17R型號微量臺式低溫離心機(jī)(Thermo公司)；UV-2550紫外分光光度計(日本島津有限公司)；Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)(型號：Universal Hood II，美國伯樂公司)；電泳儀(型號：JY600c，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 實驗藥物及試劑制備

2.1.1 花旗澤仁的制備

取配置好花旗澤仁復(fù)方，浸泡12 h，分3次，分別加12倍、8倍、6倍的蒸餾水煎煮，將3次煎煮所得溶液混合、過濾、濃縮處理直至生藥量達(dá)到0.54 g/ml，4℃保存，使用時用加熱到37℃。

2.1.2 脂肪乳的制備

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為5%的果糖、膽固醇和蔗糖以1∶1∶1的比例加入水中，攪勻，將丙硫氧嘧啶(1%)和豬油(20%)研細(xì)加入糖水中，混勻。最后結(jié)合持續(xù)加入已Tween 80的丙二醇，攪拌混勻。溫度稍降后，再次加入6%食用鹽及1%谷氨酸鈉并攪拌至均勻狀,加水定溶，4℃保存。

2.1.3 陽性藥對照藥

實驗前用蒸餾水將羅格列酮藥片配成濃度為0.4 mg/kg的溶液。4℃保存，使用前取出，常溫后使用。

2.2 2型糖尿病胰島素抵抗模型的建立

參照艾靜[9-10]的方法復(fù)制2型糖尿病胰島素抵抗模型，50只Wistar實驗大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用12 h：12h晝夜間斷照明，按體質(zhì)量將其隨機(jī)分組，正常對照組(A)：模型對照組(B)為1：4。第一階段為模型誘導(dǎo)階段，A組：連續(xù)20天喂養(yǎng)SPF級飼料；B組：連續(xù)20天喂養(yǎng)劑量為10 ml/(kg·d)的脂肪乳。隨后，連續(xù)2天對A組和B組的大鼠禁食不禁水，并對B組大鼠進(jìn)行40 mg/(kg·d)STZ的腹腔注射，A組大鼠則注射等量的蒸餾水。每次注射后15 min，對B組再次腹腔注射0.4 U的胰島素，注射后2.5 h及5 h后，對B組繼續(xù)灌胃劑量為10 ml/kg的25%葡萄糖溶液。注射STZ 72 h后，將空腹血糖≥16.7 mmol/L且胰島素敏感指數(shù)(ISI)與正常對照組差異較大的大鼠作為2型糖尿病胰島素抵抗的模型實驗大鼠。

2.3 分組及給藥

選取30只建造模成功的大鼠，并隨機(jī)分為花旗澤仁組、陽性對照組和模型對照組。以灌胃的方式按每日給藥量為5.4 g/kg的劑量給花旗澤仁組灌服花旗澤仁；0.4 mg/kg劑量給陽性藥對照組灌服羅格列酮；持續(xù)4周，其中模型對照組與空白對照組用相同劑量的蒸餾水灌服，用量為10 ml/kg。

2.4 樣本采集

末次給藥后，對大鼠進(jìn)行麻醉取血，血漿處理方法為：低速離心機(jī)中3 500 rpm離心10 min，吸取上層血清轉(zhuǎn)移至EP管中，-80℃保存。取血后，迅速打開腹腔取約100 mg胰腺組織，將所取的胰腺組織剪碎，液氮速凍2 h后移入-80℃的超低溫冰箱中保存，待測。

2.5 檢測方法

2.5.1 空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及胰島素敏感指數(shù)(ISI)檢測

用毛細(xì)玻璃管法取血，將其滴入血糖試紙，用血糖儀測定FBG。從中選取適量的血清，依照胰島素放射免疫分析試劑盒中說明書的方法檢測FINS。并用李光偉法[11]計算胰島素的敏感指數(shù)(ISI)。

ISI=ln[1/(FBG×FINS)]

2.5.2 鈣敏感受體(CaSR)mRNA實時熒光定量PCR檢測

用研缽研磨胰腺組織至粉末狀，取50 mg該粉末移入預(yù)冷1.5 ml的離心管中，用Trizol方法提取并用AccuPower RocketScript RT PreMix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在與之匹配的PCR反應(yīng)管中加入樣本溶液及相應(yīng)試劑，混合溶液后按照30℃ 5 min，60℃ 60min,95℃ 5 min以及4℃ 5 min的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并以所得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，增加cDNA樣本2.0 μl，2×Greenstar Master Mix 12.5 μl，引物F-primer(內(nèi)參β-actin F 10 pM)、引物R-primer(內(nèi)參β-actin R 10 pM)各1.0 μl，DEPC溶液8.5 μl,共25.0 μl。將溶液混合并按照95℃ 10 min，95℃ 10 s和47℃ 30 s的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR反應(yīng)，循環(huán)周期為40個。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2.5.3 蛋白印跡法(Western blot)檢測胰腺組織鈣敏感受體(CaSR)蛋白表達(dá)量及Akt活性

提取胰腺組織中的CaSR蛋白，經(jīng)凝膠電泳分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，至聚乙二烯薄膜(PVDF)上。非特異性蛋白質(zhì)于37℃的 5%牛奶封閉液中存儲1 h。隨后，用TBST洗PVDF膜，孵育一抗，將PVDF膜移入一抗，4℃下過夜。孵育二抗，將PVDF膜移入二抗，37℃下孵育1 h，用TBST洗PVDF膜。配制ECL化學(xué)發(fā)光試劑，應(yīng)將其滴于PVDF膜的正面，以確保ECL發(fā)光液在反應(yīng)2～3 min后，能夠在凝膠成像系統(tǒng)中曝光并拍照，以β-actin為內(nèi)參，目的基因與β-actin的吸光度比值來表示組織中蛋白的相對蛋白含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 花旗澤仁對大鼠體質(zhì)量、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)以及胰島素敏感指數(shù)(ISI)的影響

如表2所示，從大鼠的體質(zhì)量來看，模型對照組明顯低于空白對照組(P<0.01)；從FBG和FINS水平來看，模型對照組高于空白組，而ISI水平則明顯降低(P<0.001)；花旗澤仁組和陽性藥對照組的ISI水平明顯升高，但FBG和FINS水平較模型對照組有所降低(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數(shù)水平對比

注：與空白對照組比較，△△△P<0.001，△△P<0.01 ；與模型對照組比較，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05

3.2 花旗澤仁對胰島素抵抗(IR)大鼠胰腺組織中鈣敏感受體(CaSR) mRNA表達(dá)水平的影響

如圖1及表3所示，模型對照組CaSR mRNA表達(dá)水平與空白對照組相比明顯降低(P<0.001)；而陽性藥對照組和花旗澤仁組中CaSR mRNA的表達(dá)水平明顯高于模型對照組(P<0.01，P<0.05)。

表3 各組大鼠胰腺組織CaSR mRNA表達(dá)水平對比

注：與空白對照組比較，△△△P<0.001，**P<0.01；與模型對照組相比較，*P<0.05

圖1 各組大鼠胰腺組織CaSR mRNA表達(dá)水平對比

3.3 花旗澤仁對胰島素抵抗大鼠胰腺組織中鈣敏感受體(CaSR)蛋白表達(dá)的影響

如圖2及表4所示，模型對照組與空白對照組大鼠胰腺組織CaSR蛋白表達(dá)相比明顯降低(P<0.001)；花旗澤仁組大鼠胰腺組織中CaSR蛋白表達(dá)水平較模型對照組明顯提高(P<0.001)，而陽性藥對照組大鼠CaSR蛋白表達(dá)差異則無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組大鼠胰腺組織CaSR蛋白表達(dá)水平對比

注：與空白對照組比較，△△△P<0.001；與模型對照組比較，***P<0.001

圖2 各組大鼠CaSR蛋白表達(dá)結(jié)果注：A.空白對照組；B.模型對照組；C.花旗澤仁組；D.陽性藥對照組

3.4 花旗澤仁對胰島素抵抗(IR)大鼠胰腺組織中蛋白激酶B(AKT)活性的影響

圖3 各組大鼠磷酸化Akt蛋白表達(dá)結(jié)果注：A.空白對照組；B.模型對照組；C.花旗澤仁組；D.陽性藥對照組

如圖3及表5所示，模型對照組與空白對照組相比,大鼠胰腺組織中磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白含量明顯降低(P<0.001)；花旗澤仁組、陽性藥對照組大鼠磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表達(dá)水平較模型對照組顯著提高(P<0.01，P<0.05)。

表5 各組大鼠胰腺組織中磷酸化AKT蛋白水平對比

注：與空白對照組比較，△△△P<0.001,**P<0.01;與模型對照組比較，*P<0.05

4 討論

胰島素抵抗(IR)作為2型糖尿病的主要病因及特征，是臨床中的早期表現(xiàn)，可與糖尿病共存，多為終末靶組織對正常濃度的胰島素反應(yīng)降低引起的。這可能是因為胰島素相關(guān)受體活性缺陷，導(dǎo)致胰島素調(diào)節(jié)糖代謝異常[12]。

研究表明，胰島素胰腺器官自身也擁有胰島素抵抗，在誘導(dǎo)胰島素抵抗以及自發(fā)性環(huán)境的動物模型中均能證明胰島中存在胰島素信號傳導(dǎo)障礙。胰腺組織分泌胰島素和胰高血糖素，而持續(xù)的高血糖可損害胰島，造成胰島素的分泌功能日趨下降[13]。2型糖尿病患者的胰島β細(xì)胞會隨著糖尿病患者病程的不斷發(fā)展而減少，胰島及外分泌腺萎縮，β細(xì)胞功能衰退甚至喪失[14-18]。

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor,CaSR)是C家族中的主要成員之一，為G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein coupled receptor,GPCR)[19-22]。鈣敏感受體通過參與細(xì)胞的增殖與分化、凋亡與衰老、基因表達(dá)等過程穩(wěn)定機(jī)體鈣及其他金屬離子的平衡[23-26]。此外，細(xì)胞外Ca2+的濃度影響著 CaSR表達(dá)，在調(diào)節(jié)滲透平衡、細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)及水分的吸收方面具有舉足輕重的影響[27-28]。研究表明，CaSR激動劑可提升AKT的活性，鈣敏感受體(CaSR)拮抗劑能夠抑制AKT的活性。說明AKT與CaSR之間具有密切的關(guān)系。大量研究證實,PI3K-AKT通路上AKT的活性變化在發(fā)生胰島素抵抗時起到重要作用[29]。使PI3K信號通路進(jìn)一步激活A(yù)KT在磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸上的蘇氨酸(S473，T308)和絲氨酸兩個主要磷酸化位點，促使其發(fā)揮作用[30]。本實驗前期研究結(jié)果表明，大鼠灌胃脂肪乳，可抑制大鼠胰腺組織上CaSR mRNA及蛋白表達(dá)，并抑制AKT活性，導(dǎo)致2型糖尿病胰島素抵抗發(fā)生[31]。

研究表明，花旗澤仁組CaSR mRNA、CaSR蛋白表達(dá)及AKT的活性與模型對照組相比均有明顯提升，表明花旗澤仁可調(diào)節(jié)鈣敏感受體表達(dá)，激活PI3K-AKT信號通路，繼而緩解胰島素抵抗。有報道顯示，西洋參皂苷具有促進(jìn)葡萄糖吸收及利用[32]。薏苡仁作為一種利尿藥，其多糖能增加葡萄糖激酶的活性，促進(jìn)葡萄糖在機(jī)體組織中的吸收[33]，澤瀉的提取物可通過緩解脂質(zhì)代謝紊亂來改善胰島素抵抗[34]。因此推斷，這些有效成分可能是花旗澤仁改善胰島素抵抗的主要因素[35-38]。

本研究通過2型糖尿病IR大鼠模型探究了花旗澤仁對胰腺組織中CaSR表達(dá)的影響，并認(rèn)為花旗澤仁可通過調(diào)節(jié)胰腺組織上CaSR的表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K-AKT信號通路上AKT的S473和T308磷酸位點，增高AKT活性，從而達(dá)到治療2型糖尿病胰島素抵抗的目的。希望在花旗澤仁的后續(xù)研究中能夠?qū)Ψ街袉挝吨兴幍挠行ё饔贸煞诌M(jìn)行深入研究，以期開發(fā)一種治療糖尿病的成熟有效新劑型。

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