江楊帆 何素冰 吳納新 蔡 標(biāo) 刁慧敏 戴陳偉 辛及娣

細胞技術(shù)作為醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)[1-2]，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)科研工作的必備技能，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域，與其他學(xué)科領(lǐng)域的交叉研究也日趨增多[3-4]。傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)通常為細胞生長在單層二維的玻璃或塑料平面上，屬于二維培養(yǎng)，具有較好的伸展性，但不能充分真實模擬體內(nèi)生長模式，最終影響細胞增殖、分化、凋亡、基因和蛋白表達等細胞過程。與二維培養(yǎng)系統(tǒng)相比，三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能更準(zhǔn)確地反映細胞在組織中的實際微環(huán)境，但三維細胞因為細胞呈現(xiàn)出層疊狀而不能有效地使光穿過，導(dǎo)致細胞觀察與二維細胞培養(yǎng)中的可視化存在明顯差異，故三維細胞模型的檢測在成像、分析、定量和自動化方面遠不如傳統(tǒng)細胞模型方便，有待于技術(shù)的進一步發(fā)展提高。兩種培養(yǎng)系統(tǒng)存在各自的優(yōu)點和不足，現(xiàn)將細胞三維培養(yǎng)與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)技術(shù)研究應(yīng)用現(xiàn)狀作如下綜述，以期為細胞培養(yǎng)的選擇提供依據(jù)。

1 細胞三維培養(yǎng)及其優(yōu)缺點

三維細胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensional cell culture, TDCC)是將細胞放置在模仿體內(nèi)細胞環(huán)境的三維培養(yǎng)載體內(nèi)進行體外培養(yǎng), 細胞在三維載體的立體空間結(jié)構(gòu)中生長, 構(gòu)成三維的細胞載體復(fù)合物[5]。相較于傳統(tǒng)的二維單層細胞培養(yǎng)，TDCC能更好地模擬體內(nèi)條件，能更緊密地模仿復(fù)雜的細胞組織間相互作用以及在體內(nèi)的微環(huán)境，為細胞的最佳生長、分化提供了一個合適的微環(huán)境，并有在體外創(chuàng)造組織樣結(jié)構(gòu)的能力。通過允許單個細胞維持其正常的三維形狀，有助于細胞與相鄰細胞間形成復(fù)雜的相互作用和信號接收及發(fā)送，為不同類型的細胞培養(yǎng)創(chuàng)造一個更自然的生長環(huán)境。

2 傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)及其優(yōu)缺點

傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)指細胞浸入到培養(yǎng)液中在普通的玻璃或塑料培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板的表面生長，并且只會沿著二維平面延伸，故傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)為二維細胞培養(yǎng)模式。

離體組織細胞可通過傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)在體外進行生長繁殖，在較簡單的條件下就能長時間直接觀察，研究內(nèi)容也便于通過倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細胞儀、免疫組化等技術(shù)來檢測并記錄結(jié)果。傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)因其研究費用較低，而且可以提供大量生物性狀相似的實驗對象，廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、組織胚胎學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科。

雖然體外的細胞比體內(nèi)細胞的代謝可能更恒定，但是，體外培養(yǎng)的環(huán)境與體內(nèi)的環(huán)境不完全相同，缺乏體內(nèi)的動態(tài)平衡。因此，細胞的生長更趨于單一化，其細胞形態(tài)和功能可能會發(fā)生一定程度的改變，所以體外傳統(tǒng)培養(yǎng)的細胞無法與體內(nèi)的細胞完全等同，隨著TDCC的逐步突破并日趨成熟完善，傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)向TDCC的轉(zhuǎn)變將成為未來的發(fā)展趨勢。

3 細胞三維培養(yǎng)與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)應(yīng)用比較

3.1 腫瘤研究應(yīng)用 動物模型是腫瘤研究的重要工具，可監(jiān)測腫瘤藥物的生物利用度、治療效果和劑量限制毒性等。然而，動物模型因具有成本較高、物種差異等不足，在腫瘤研究中的倫理問題存在較大爭議。體外細胞三維培養(yǎng)模型能較真實地模擬體內(nèi)環(huán)境，它的使用可以減少用于腫瘤研究和藥物評價的動物數(shù)量[6]。

在腫瘤藥物篩選中，自然真實的三維環(huán)境將有助于更有效識別殺死癌癥的藥物或?qū)φ＜毎麧撛谖ｋU的藥物。此外，腫瘤的侵襲和血管生成等復(fù)雜過程，同樣可以使用三維模式來進行模擬。三維模型也被應(yīng)用于腫瘤抑制作用及其相關(guān)機制的研究，如缺氧誘導(dǎo)的耐藥性[7]、轉(zhuǎn)移樣侵襲和癌細胞擴散[8]和癌相關(guān)的成纖維細胞浸潤[9]等。

總之，腫瘤生物學(xué)的研究主要是基于體外實驗細胞系，而TDCC能更好地代表組織結(jié)構(gòu)和細胞微環(huán)境，三維癌癥模型主要目標(biāo)是縮小二維細胞系、動物模型和臨床研究之間的差距。因此，通過開發(fā)先進三維細胞培養(yǎng)的體外模型，能夠更加真實模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境[10-11]。

3.2 藥物藥理研究應(yīng)用 篩選藥物的標(biāo)準(zhǔn)程序包括在臨床前和臨床階段對新的候選藥物進行全面評價，許多藥物在臨床實驗階段失敗，為了降低成本，最好在動物實驗之前盡早排除有毒化合物，因此，以細胞為基礎(chǔ)的分析技術(shù)通常是藥物發(fā)現(xiàn)過程的一個關(guān)鍵的部分，它提供了一種簡單快速，成本效益高的工具，避免了大規(guī)模和高成本的動物實驗[12-13]。研究人員常通過細胞培養(yǎng)來觀察不同藥物對離體細胞的作用，從而為藥物的藥效作用提供實驗依據(jù)以及臨床實際使用參考，與傳統(tǒng)二維模式相比，三維培養(yǎng)方式與觀察到的生理條件更加密切相關(guān)、更為真實，更好地預(yù)測了體內(nèi)藥物處理，能夠嚴(yán)格預(yù)測人類藥物作用和安全性[14]。Nata?a等[15]通過細胞三維模型比較已知化療藥物的輻射增敏效應(yīng)，結(jié)果顯示，在有效治療濃度范圍內(nèi)，三維模型對于篩選新化合物更加高效。綜上所述，TDCC在早期藥物發(fā)現(xiàn)中將有廣泛應(yīng)用，如疾病建模、目標(biāo)識別和驗證、篩選、藥物療效和安全評估等。

三維細胞培養(yǎng)還有望成為抗病毒藥物體外研究的理想工具，Koban等[16]通過對人表皮角質(zhì)形成細胞NHEK三維培養(yǎng)和單層培養(yǎng)的比較來分析吉非替尼的抗病毒療效，結(jié)果顯示，吉非替尼在三維培養(yǎng)中細胞增殖和病毒復(fù)制顯著降低，比傳統(tǒng)單層培養(yǎng)低100倍，大大降低了細胞毒性水平。故三維培養(yǎng)因更準(zhǔn)確模擬體內(nèi)生理環(huán)境而有助于理解病毒與宿主之間的相互作用及機制，促進抗病毒藥物的發(fā)展，從而在預(yù)防、診斷和治療新型病毒性疾病具有巨大潛力。

3.3 干細胞研究應(yīng)用 干細胞在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用不可或缺，特別是對于成功修復(fù)長期自我更新的組織，如皮膚的應(yīng)用，這使其成為再生醫(yī)學(xué)治療的一個潛在的強有力細胞來源。人類多能干細胞可以在體外培養(yǎng)并分化為人體的所有細胞類型，這些應(yīng)用需要大量的高質(zhì)量的細胞。因此，一個用于生產(chǎn)人類多能干細胞及其后代的良好三維系統(tǒng)顯得尤為重要，三維生物系統(tǒng)可以提高人類胚胎干細胞衍生的多能干細胞和成人成體干細胞植入體內(nèi)后的生存率和再生能力[17]，這一點已被眾多研究人員的實驗結(jié)果所證實。Lee等[18]通過實驗證實了干細胞的三維培養(yǎng)較傳統(tǒng)二維培養(yǎng)具有更高的生存率和基因組穩(wěn)定性；Barsby等[19]通過實驗證明在同一時間內(nèi)三維培養(yǎng)模型誘導(dǎo)干細胞分化水平遠超出二維培養(yǎng)，三維細胞培養(yǎng)大大促進胚胎干細胞分化；Lin等[20]也通過實驗證明了三維條件下培養(yǎng)的干細胞具有更好的分化潛能。

三維細胞模型使干細胞分化在疾病建模和再生醫(yī)學(xué)中的潛力得以發(fā)揮[21]。例如與傳統(tǒng)單層培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)能顯著改善肝細胞的分化和功能，結(jié)合干細胞三維聚集，干細胞可成為肝臟疾病細胞治療一個新的來源[22]。另外，在組織工程領(lǐng)域，臨床上肌肉骨骼組織的需求特別高，尤其是軟骨和骨缺損[23]，三維技術(shù)也已被應(yīng)用于骨及軟骨的損傷再生；三維細胞模型還為神經(jīng)元生長提供了良好的支架[24]，神經(jīng)元在其中可以自由地向各個方向生長，形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，這為神經(jīng)細胞再生的研究提供了更好的方法[25]，并為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了前景。

4 展望

目前眾多研究對細胞三維培養(yǎng)與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)模式的優(yōu)缺點進行了比較分析。細胞三維培養(yǎng)因更加真實地模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及微環(huán)境，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各個研究領(lǐng)域，取得了一定的成就。但細胞三維培養(yǎng)技術(shù)有著諸多優(yōu)點的同時，仍然需要面臨不斷發(fā)展和應(yīng)對許多挑戰(zhàn)，例如高質(zhì)量成像技術(shù)的發(fā)展，三維培養(yǎng)中復(fù)雜形態(tài)功能的評估，三維培養(yǎng)設(shè)備的發(fā)展以及培養(yǎng)方法的完善等。綜上所述，三維培養(yǎng)作為最主要的細胞培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)展空間和挑戰(zhàn)并存。有待進一步完善。

[1] GEORGE S M,MOON H.Digital microfluidic three-dimensional cell culture and chemical screening platform using alginate hydrogels[J].Biomicrofluidics,2015,9(2):024116.

[2] KOPANSKA K S,BUSSONNIER M,GERALDO S,et al.Quantification of collagen contraction in three-dimensional cell culture[J].Methods Cell Biol,2015,125(1):353-372.

[3] GODUGU C,SINGH M.AlgiMatrixTM-based 3D cell culture system as an in vitro tumor model:an important tool in cancer research[J].Methods Mole Biol,2016,1379(1):117-128.

[4] JANG M,NEUZIL P,VOLK T,et al.On-chip three-dimensional cell culture in phaseguides improves hepatocyte functions in vitro[J].Biomicrofluidics,2015,9(3):034113.

[5] ANTONI D,BURCKEL H,JOSSET E,et al.Three-dimensional cell culture:a breakthrough in vivo[J].Int J Mol Sci,2015,16(3):5517-5527.

[6] LV D,HU Z,LU L,et al.Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery[J].Oncol Letters,2017,14(6):6999-7010.

[7] WENZEL C,RIEFKE B,GRüNDEMANN S,et al.3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions[J].Exp Cell Res,2014,323(1):131-143.

[8] VINCI M,GOWAN S,BOXALL F,et al.Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation[J].BMC Biol,2012,10(29):1-20.

[9] WENZEL C,OTTO S,PRECHTL S,PARCZYK K,et al.A novel 3D high-content assay identifies compounds that prevent fibroblast invasion into tissue surrogates[J].Exp Cell Res,2015,339(1):35-43.

[10]DE L A,RAIMONDI L,SALAMANNA F,et al.Relevance of 3d culture systems to study osteosarcoma environment[J].J Exp Clin Cancer Res,2018,37(1):5517-5527.

[11]BENIEN P,SWAMI A.3D tumor models: history,advances and future perspectives[J].Future Oncol,2014,10(7):1311-1327.

[12]LOVITT C J,SHELPER T B,Avery V M.Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery[J].Biology,2014,3(2):345-367.

[13]FANG Y,EGLEN R M.Three-Dimensional cell cultures in drug discovery and development[J]. Slas Discovery,2017,22(5):456-472.

[14]LEI Y,SCHAFFER DV.A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation[J].Proc Nati Acad Sci USA,2013,110(52):5039-5048.

[16]KOBAN R,NEUMANN M,DAUGS A,et al.A novel three-dimensional cell culture method enhances antiviral drug screening in primary human cells[J].Antiviral Res,2017,150(2):20-29.

[17]HWANG N S,VARGHESE S,LEE H J,et al.In vivo commitment and functional tissue regeneration using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells[J].Proc Nati Acad Sci USA,2008,105(52):20641-20646.

[18]LEE M O,JEON H,SON M Y,et al.Clump-passaging-based efficient 3D culture of human pluripotent stem cells under chemically defined conditions[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,493(1):723-730.

[19]BARSBY T,BAVIN E P,GUEST D J.Three-dimensional culture and transforming growth factor beta3 synergistically promote tenogenic differentiation of equine embryo-derived stem cells[J].Tissue Eng Part A,2014,20(19-20):2604-2613.

[20]LIN C Y,HUANG CH,WU YK,et al.Maintenance of human adipose derived stem cell (hASC) differentiation capabilities using a 3D culture[J].Biotechnol Lett,2014,36(7):1529-1537.

[21]熊鷹，余歡歡，張龍成，等.干細胞技術(shù)的研究熱點領(lǐng)域與最新進展[J].生物技術(shù)進展，2014,4(4)：258-262.

[22]王楠，鄒偉，劉鵬，等.肝臟干細胞研究及應(yīng)用前景展望[J].中國組織工程研究，2012,16(6)：1119-1124.

[23]王曉峰，吳巖.骨組織工程中干細胞的研究與應(yīng)用[J].中國組織工程研究，2013,17(19)：3558-3565.

[24]楊盛，向然，張飛燕，等.細胞其培養(yǎng)模型及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報，2016，51(3)：338-346.

[25]張震，李瑩，耿亞偉，等.納米支架及合成技術(shù)在神經(jīng)組織再生的應(yīng)用[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2017，33(4)：459-462.