孫 宇 雍 翔 孫 祝 尹 群 趙玉魁

肺癌是發(fā)病率和死亡率較高的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤之一。外科手術(shù)一直是早期肺癌患者的首選治療方案，但是由于肺癌起病隱匿，惡化程度較高，很多患者確診時已至中晚期，錯過了手術(shù)的最佳時機(jī)[1-2]。因此，尋找特異性的作用靶點(diǎn)、早診斷、早干預(yù)是腫瘤治療領(lǐng)域相關(guān)專家和學(xué)者一直積極探索的課題。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)屬于酪氨酸蛋白激酶家族成員之一，因其具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及血管形成的作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程當(dāng)中的影響日益受到人們的關(guān)注[3-4]。趨化因子20(chemokine ligand 20，CCL20)是趨化因子CC家族重要成員之一，CCL20在肝臟、肺臟、扁桃體等器官中呈高表達(dá)，尤其是與肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。但目前鮮有研究明確IGF-1和CCL20與肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。本研究通過免疫組化方法檢測IG-1和CCL20在肺鱗癌組織中的表達(dá)水平，并探討其與患者臨床病例特征及預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年2月至2015年2月皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院收治的30例肺鱗癌患者術(shù)后新鮮組織標(biāo)本，檢測2GF-1及CCL20。其中，男性19例，女性11例；年齡31～69歲，平均(52.47±9.56)歲；16例患者術(shù)前出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；按國際抗癌聯(lián)盟(2016年)TNM腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)分期[6]，I～Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ1期17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)關(guān)于肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，未合并其他惡性腫瘤者；②所有患者術(shù)前未接受放療、化療或其他輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重肝腎功能障礙者；②合并其他惡性腫瘤者；③妊娠哺乳期女性。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測方法 按照SP免疫組化檢測試劑盒(北京中衫橋公司生產(chǎn))說明書標(biāo)明的實(shí)驗(yàn)步驟檢測所有病理切片中IGF-1和CCL20蛋白的表達(dá)：①將石蠟包埋組織切片，脫蠟水化后，切片，置于載玻片上，烘干48 h后待用；②抗原熱修復(fù)；③滅活內(nèi)源性過氧化物酶；④封閉；⑤加入抗人IGF-1抗體或CCL20抗體(美國Abcam公司，1:250稀釋)孵育；⑥加入二抗孵育；⑦滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑顯色；⑦蘇木精復(fù)染；⑧將染色后的病理切片置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇10個視野，觀察細(xì)胞陽性表達(dá)情況。

1.2.2 結(jié)果判定 病理結(jié)果由病理科醫(yī)師獨(dú)立判斷,將病理片置于光學(xué)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)下，選擇10個不同的視野,其中每個視野選取100個細(xì)胞，分析細(xì)胞染色強(qiáng)度以及占據(jù)的比例，積分=細(xì)胞染色強(qiáng)度×細(xì)胞比例，根據(jù)積分判斷免疫組化結(jié)果：①0分(陽性率為0)；②1分(陽性率<25%)；③2分(陽性率25%～50%)；④3分(陽性率50%～75%)；⑤4分(陽性率>75%)。同時觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度：①0分(陰性)；②1分(弱染色)；③2分(中度染色)；④3分(強(qiáng)染色)。染色指數(shù)(labeling index，LI)=陽性細(xì)胞率×染色強(qiáng)度，根據(jù)總分?jǐn)?shù)將切片分為1～4級：①1級(0～1分)為陰性；②2級(2～3分)為弱陽性；③3級(4～8分)為中度陽性；④4級(9～12分)為強(qiáng)陽性。2級以上即為陽性表達(dá)[5]。詳見圖1。

1.2.3 隨訪 治療結(jié)束后頭3個月，每個月復(fù)查1次；3～12個月，每3個月復(fù)查1次；1年后，每6個月復(fù)查1次。復(fù)查項(xiàng)目包括體檢、血常規(guī)、肝功能、胸部CT等。統(tǒng)計(jì)所有患者3年生存率。生存率=生存患者數(shù)/總患者數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，采用kaplan-meier計(jì)算中位生存時間，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析IGF-1、CCL20表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1、CCL20表達(dá)與患者病理特征的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示，18例(60.0%)患者IGF-1蛋白呈陽性表達(dá)，23例(76.67%)患者CCL20呈陽性表達(dá)。單因素分析顯示，IGF-1表達(dá)與患者TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；CCL20表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。詳見表1。

表1 IGF1、CCL20表達(dá)與患者一般臨床資料及病理特征的關(guān)系

表1續(xù)

因素例數(shù)IGF-1蛋白[例(%)]CCL20蛋白[例(%)]陽性P值*陽性P值*分化程度1.0000.418 高-中分化21(50.00) 低-未分化2817(60.71)1(50.00)22(78.57)浸潤深度0.2640.017 T1、T2136(46.15) T3、T41712(70.59)6(40.00)17(80.95)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0240.031 有1613(81.25) 無145(35.71)15(93.75)8(57.14)腫瘤直徑0.7100.390 <4 cm158(53.33) ≥4 cm1510(66.67)10(66.67)13(86.67)TNM分期0.0080.025 I～Ⅱ期134(30.77) Ⅲ～Ⅳ期1714(82.35)7(53.85)16(94.12)

注：*表示采用Fisher確切概率法

2.2 IGF-1及CCL20與肺鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 所有患者平均隨訪時間為(21.38±7.46)個月?；颊?年總生存率為63.33%(19/30)。IGF-1陽性組患者中位生存時間為17個月，IGF-1陰性組患者中位生存時間為23個月；CCL20陽性組患者中位生存時間為16個月，CCL20陰性組患者中位生存時間為23個月。經(jīng)Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析Log-rank檢驗(yàn)單因素分析，結(jié)果顯示，浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、IGF-1表達(dá)、CCL20表達(dá)對生存期有明顯影響(P<0.05)。采用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響肺鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、IGF-1、CCL20陽性表達(dá)與肺鱗癌患者預(yù)后密切相關(guān)，是影響肺鱗癌患者生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。詳見表2。

表2 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響肺鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討論

肺癌是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率位于各種癌癥疾病之首。尤其是肺鱗癌，雖然在我國發(fā)病率低于肺腺癌，但是由于目前尚缺乏特異性靶向治療藥物，肺鱗癌患者預(yù)后較差，很多患者即使采取了肺切除術(shù)，仍然存在較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，因此探討肺鱗癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找針對肺鱗癌治療有效的潛在靶基因具有十分重要的臨床價(jià)值。

胰島素樣生長因子是與胰島素高度同源的蛋白分子，可與IGF1以及IGF兩種配體結(jié)合，通過激活磷酸肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase，PI3K)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路等，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡等惡性生物學(xué)行為[7]。有研究[8]顯示，IGF1高表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最新研究[9]表明，非小細(xì)胞癌患者的標(biāo)本當(dāng)中超過30%存在著IGF1基因的陽性,同時超過10%的患者存在著基因擴(kuò)增問題，同時基因拷貝數(shù)在非鱗癌患者以及鱗癌患者之間存在顯著差異，并且IGF1陽性表達(dá)同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在顯著正相關(guān)，同時肺鱗癌組織當(dāng)中的IGF1表達(dá)顯著高于癌旁健康組織。在本項(xiàng)研究中，筆者經(jīng)免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)IGF1在肺鱗癌組織中陽性表達(dá)率高達(dá)60%，因此推測IGF-1高表達(dá)可能與肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的聯(lián)系。通過進(jìn)一步分析IGF-1與肺鱗癌患者病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，IGF1的表達(dá)率隨著患者病理學(xué)分級的下降而上調(diào)，且IGF1高表達(dá)患者的3年生存率明顯低于IGF-1陰性表達(dá)患者,提示IGF1高表達(dá)是影響肺鱗癌患者預(yù)后的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。同時IGF1的高表達(dá)同患者的腫瘤復(fù)發(fā)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素存在聯(lián)系。本研究結(jié)果與國內(nèi)外大多數(shù)研究結(jié)論基本一致[10-12]。

趨化因子與炎性反應(yīng)、免疫細(xì)胞歸巢等生物學(xué)過程密切相關(guān)[13-14]。近幾年，隨著分子生物學(xué)的深入發(fā)展，有學(xué)者認(rèn)為由惡性腫瘤分泌的趨化因子通過與不同受體結(jié)合后刺激血管生成、炎性細(xì)胞的浸潤以及蛋白降解等，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[15]。既往有研究[16]發(fā)現(xiàn)，肺癌組織當(dāng)中CCR6以及CCL20的表達(dá)顯著高于正常的肺組織，且同患者的分期存在正相關(guān)，高表達(dá)的CCR6肺癌患者標(biāo)本細(xì)胞添加CCL20共同培育，細(xì)胞偽足顯著增加，提示CCL20有著強(qiáng)化肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力以及侵襲能力的效果。本組資料顯示，CCL20表達(dá)同肺鱗癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、TNM分期等存在顯著正相關(guān)(P<0.05)，在Ⅲ、Ⅳ期肺鱗癌患者組織當(dāng)中的CCL20陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期患者。這表明肺鱗癌患者隨著腫瘤浸潤深度的加深以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，患者腫瘤組織內(nèi)CCL20陽性表達(dá)率逐漸上調(diào)。因此可以推測CCL20可能與肺鱗癌發(fā)展以及侵襲密切相關(guān)。目前已有研究表明檢測趨化因子CCL20表達(dá)可作為判斷肺鱗癌患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)[17]。但是關(guān)于CCL20具體作用于肺鱗癌的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，IGF1以及CCL20在肺鱗癌患者組織當(dāng)中的表達(dá)對肺鱗癌病情的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移有重要影響，在篩查肺鱗癌患者病情以及評估患者預(yù)后質(zhì)量方面有重要的參考價(jià)值,能夠?yàn)榛颊叩陌邢蛑委熖峁┧悸贰?/p>

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