孔令尚 劉 彪 沈奧林 魏凱凱 萬圣云

下肢深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)是下肢深部靜脈形成異常血凝塊的外周血管疾病，能引起嚴(yán)重的并發(fā)癥和較高的死亡率[1]。如急性期常見的致死性肺動脈栓塞、慢性期致殘性的血栓后綜合征都威脅著患者的生命健康。但DVT早期診斷目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有輔助檢查都是血栓形成后才能做出診斷，因而需要一種敏感性和特異性高的臨床診斷標(biāo)志物。有研究[2]顯示，健康對照者和靜脈栓塞患者血漿miRNA表達(dá)存在差異。Qin等[3]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在深靜脈血栓中起著重要作用，血清miRNA有可能作為DVT診斷的潛在標(biāo)志物。血漿D-二聚體(D-dimer，D-D)檢測是目前診斷DVT最常用的篩查方法[4]。其對靜脈栓塞性疾病診斷靈敏度達(dá)92%～100%，但特異性較差，僅40%左右，單獨(dú)用D-D不能作為診斷DVT的標(biāo)準(zhǔn)[5]。結(jié)合筆者前期基因芯片檢測DVT患者，發(fā)現(xiàn)DVT患者外周血單個核細(xì)胞微小RNA-483-3p(miR-483-3p)升高，且影響靜脈血栓的溶解再通[6]。本研究通過對照研究，比較外周血單個核細(xì)胞 miR-483-3p表達(dá)量和血漿中D-D含量聯(lián)合檢測在DVT組與無DVT組差異，探討兩者對DVT的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年9月至2017年6月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院確診的DVT患者30例為血栓組，并選取同期住院非DVT患者30例為對照組。檢測兩組患者miR-483-3p及D-D。所有DVT患者均經(jīng)彩色多普勒超聲或下肢血管造影證實，并符合DVT診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，同時排除高血壓、糖尿病、腫瘤等病史。對照組患者經(jīng)彩色多普勒超聲或下肢血管造影確認(rèn)無下肢靜脈血栓，均為皮下淺表脂肪瘤或皮脂腺囊腫的局部包塊,且無其他疾病的患者。DVT組患者中，男性14例，女性16例；年齡25～84歲，平均(56.63±14.44)歲；中央型7例(23.33%)、周圍型6例(20.00%)、混合型17例(56.67%)，均為初發(fā)者，且均在1周內(nèi)的急性期患者。對照組中，男性17例，女性13例；年齡20～78歲，平均(54.83±17.73)歲。兩組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者皆知情同意。

1.2 方法 比較miR-483-3p和D-D分別在DVT組和對照組之間有無統(tǒng)計學(xué)差異；比較miR-483-3p及D-D聯(lián)合檢測與兩者單獨(dú)診斷DVT敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和診斷準(zhǔn)確率的差異。通過受試者工作特征曲線(ROC)并計算曲線下面積(AUC)，評價miR-483-3p聯(lián)合血漿D-D對DVT的診斷效能。

1.2.1 標(biāo)本收集 患者入院當(dāng)天采集外周靜脈血5 mL，分別存于含有肝素的無菌離心管及含有檸檬酸鈉的無菌離心管中。

1.2.2 miR-483-3p表達(dá)量的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-483-3p表達(dá)量。將采集的血標(biāo)本進(jìn)行磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)等體積稀釋，加到Ficoll-Paque人淋巴細(xì)胞分離液上，離心后，吸取單個核細(xì)胞層，提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實時定量PCR反應(yīng)，引物序列如下：U6 RT primer 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；hsa-miR-483-3p RT primer 5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAAGACG-3’；Forward primer 5’-GGTGTCACTCCTCTCCTCC-3’；Reverse primer 5’-CAGTGCGTGTCGTGGA-3’。每個樣品的CT值以U6作為內(nèi)參進(jìn)行校正，得到△CT值，用2-△△CT法計算miR-483-3p的表達(dá)量。

1.2.3 D-D檢測 血標(biāo)本離心后，吸取上層血漿，用Sysmex CS5100全自動凝血分析儀測定血漿中D-D值，免疫過濾膠體金顯色反應(yīng)法采用同種抗體夾心，以包被的抗體捕獲血漿中抗原(D-D)，加入偶聯(lián)有膠體金的同種抗體顯色，D-D含量以500 μg/mL為參考點(diǎn)，>500 μg/mL為陽性[8]。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者miR-483-3p表達(dá)量比較 血栓組患者外周血單個核細(xì)胞miR-483-3p表達(dá)較對照組升高[(3.5794±1.5696)vs(0.7736±0.3698)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.001，P<0.01)。觀察組中，28例患者miR-483-3p升高；對照組中，miR-483-3p升高4例；ROC曲線計算得出診斷DVT的靈敏度93.33%，特異性86.67%，陽性預(yù)測值為87.50%，陰性預(yù)測值為92.93%，診斷準(zhǔn)確率為90.00%。

2.2 兩組患者血漿D-D水平比較 血栓組患者血漿D-D值較對照組升高，中位數(shù)[5.60(0.24～39.65)μg/mLvs0.23(0.10～0.76)μg/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(w=68.000，P<0.01)。30例DVT患者中，29例患者D-D升高；對照組中，D-D升高7例；ROC曲線計算得出DVT診斷敏感性96.67%，特異性76.67%，陽性預(yù)測值為80.63%，陰性預(yù)測值為95.82%，診斷準(zhǔn)確率為86.67%。單個核細(xì)胞miR-483-3p對血栓的診斷準(zhǔn)確性與血漿D-D差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.156，P=0.876)。

2.3 miR-483-3p及D-D聯(lián)合檢測與兩者單獨(dú)診斷DVT的比較 29例診斷準(zhǔn)確，ROC曲線計算得出miR-483-3p及D-D聯(lián)合檢測診斷DVT的敏感性96.63%，特異性為90.00%，陽性預(yù)測值為90.58%，陰性預(yù)測值為96.44%，診斷準(zhǔn)確率為93.82%，和單獨(dú)應(yīng)用miR-483-3p或D-D相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.505，P=0.044， Z=1.497，P=0.044)。ROC曲線分析顯示，miR-483-3p聯(lián)合D-D對DVT患者的診斷價值較大，AUC為0.938。詳見圖1、2。

圖1 miR-483-3p及D-二聚體單獨(dú)及兩者聯(lián)合對DVT診斷的ROC曲線

圖2 miR-483-3p聯(lián)合D-二聚體對DVT診斷的ROC曲線

3 討論

DVT是繼心血管疾病和腦卒中之后外周血管最常見的疾病，隨著社會進(jìn)入老齡化，外周血管疾病逐漸增加[9]。每年美國新增DVT患者約90萬人，其中，約有30萬人死于肺動脈栓塞[10]。急性期血栓脫落風(fēng)險尤其大，常會引起致死性肺動脈栓塞，但早期由于無特征性表現(xiàn)，常難以明確診斷，致使DVT漏診或誤診而延誤治療。

MicroRNA(miRNA)是核苷酸長度約22個的非編碼小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄層面抑制其靶基因的翻譯，參與胚胎組織發(fā)育、神經(jīng)分化、細(xì)胞增殖遷移、血管生成和免疫反應(yīng)等過程，在疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮作用。miRNA可以從細(xì)胞內(nèi)釋放到血液成為循環(huán)miRNA，并穩(wěn)定存在于外周循環(huán)中，易于檢測，敏感性高，可能成為診斷和檢測血栓性疾病新的生物標(biāo)志物。有研究[11]顯示，miRNA在血栓溶解再通中發(fā)揮著重要作用。miRNA在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制和生物學(xué)功能被漸漸闡明[12-16]。Starikova等[2]研究顯示，在健康對照者和靜脈栓塞性疾病患者血漿中miRNA存在表達(dá)差異。Qin等[3]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在深靜脈血栓中起著重要作用，血清miRNA有可能替代D-D作為DVTD的診斷標(biāo)志物。有研究[6,11]發(fā)現(xiàn)，miR-483和miR-199a等在DVT患者中表達(dá)量明顯發(fā)生變化，參與血管形成和血栓的溶解再通。

MiR-483-3p屬于miR-483家族成員，染色體位于11p15.5胰島素樣生長因子基因內(nèi)含子內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮作用。筆者前期研究[6]顯示，上調(diào)miR-483-3p能抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢到靜脈血栓和抑制對靜脈血栓的溶解再通，下調(diào)miR-483-3p能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢和促進(jìn)對靜脈血栓的溶解再通。相關(guān)文獻(xiàn)[13]顯示，miRNA的變化可能與D-D相關(guān)。循環(huán)miRNA與D-D或多種循環(huán)miRNA聯(lián)合可能在靜脈栓塞性疾病診斷和監(jiān)測中具有更高的靈敏度和特異性。而深靜脈血栓miRNA的研究還處于起步階段，需要更多更深的研究來探索其作用機(jī)制。

D-D是纖維蛋白原降解形成的特異產(chǎn)物，提示機(jī)體高凝狀態(tài)或纖溶存在，是特異的纖溶標(biāo)志物，是血栓形成或溶解的證據(jù)，可反映機(jī)體凝血功能，目前檢測血漿D-D是診斷DVT最常用的篩查方法[4]。但D-D在外傷、手術(shù)后、惡性腫瘤、糖尿病、老年人、腎功能不全、心肌梗死、危重癥和孕婦等情況下也會升高。其對靜脈栓塞性疾病診斷靈敏度達(dá)92%～100%，但特異性較差，僅40%左右[14]。因此，單獨(dú)依據(jù)D-D不能作為診斷DVT的標(biāo)準(zhǔn)，其作用主要在于排除，其陰性者排除DVT 的準(zhǔn)確性可達(dá)98%～100%[7,17]，對DVT高度可疑者，行血漿D-D檢測，若D-D陰性者，可基本排除DVT的存在。

本研究顯示，D-D預(yù)測DVT的特異性為76.67%，但陰性預(yù)測值為95.78%，其陰性排除診斷DVT的效能較高；miR-483-3p診斷DVT的特異性為86.67%，高于D-D，其陰性預(yù)測值(92.93%)稍低于D-D，但同樣具有較高的陰性排除效能，兩者聯(lián)合陰性預(yù)測值達(dá)96.44%，具有更高的DVT排除診斷效能，兩者若都為陰性，診斷DVT的可能性較??；miR-483-3p和D-D診斷DVT的準(zhǔn)確性分別為90.00%和86.67%，兩者聯(lián)合診斷DVT的AUC為0.938，準(zhǔn)確性更高。

綜上所述，外周血miR-483-3p聯(lián)合D-D對DVT的診斷價值高于miR-483-3p或D-D單獨(dú)對DVT的診斷，具有更高的敏感度、特異度、準(zhǔn)確性和陰性預(yù)測值，兩者聯(lián)合可作為診斷下肢深靜脈血栓的參考指標(biāo)。前期基因芯片檢測DVT患者miR-483-3p升高，通過本研究進(jìn)一步證實芯片結(jié)果，希望后期通過更大樣本的前瞻性多中心研究，進(jìn)一步研究兩者聯(lián)合檢測對DVT的早期診斷和預(yù)后評估的臨床價值。

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