馬瑩瑩，鄒朝暉，彭林紅

齲齒是在以細菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進行性破壞的感染性疾病［1］。它對牙體組織的破壞以及引起的并發(fā)癥嚴重影響著人們的口腔健康和生活質(zhì)量。目前氟化物、免疫和中草藥是常用的防齲方法，其中氟化物防齲是目前普遍公認的防齲方法，但氟化物的使用安全性和耐氟菌株的產(chǎn)生，都為齲病預防提出了新的課題。免疫防齲安全性差，價格昂貴，不能在短期內(nèi)應用；中草藥成分復雜，藥理作用多樣，對齲病的預防是多因素綜合作用的結(jié)果而不容易控制，因此尋找新的更為有效的防齲方法一直是學者們研究的熱點。光動力療法（photondynamic therapy，PDT）是一種新型治療方法，能有效地殺傷細菌和病毒，在感染性疾病中有很好的應用前景［2－5］。 研究表明PDT對不論是在浮游狀態(tài)［6，7］、菌斑刮除物［8］，還是生物膜狀態(tài)下［9－12］的口腔致病菌，都具有很好的殺滅作用，且具有不耐藥、可重復等許多優(yōu)點。

光動力療法被越來越多地應用于臨床治療，但其對齲病的研究僅處于體外致齲模型階段，尚未用于齲病的臨床治療，其使用的參數(shù)安全范圍及對周圍組織的影響仍是值得研究和探討的。在光動力的三要素中（光，光敏劑和氧），光照功率是最重要的可控參量之一，通過選擇光照功率可以調(diào)控PDT的殺傷強度和范圍，在確保PDT療效的同時又能避免或減輕對周圍組織的損傷。基于目前僅見到光動力療法對大鼠口腔黏膜的研究報道，對大鼠致齲模型牙髓組織的研究報道甚少，該研究通過建立大鼠齲齒模型，探討不同光照功率對牙髓組織的影響，為光動力療法用于齲病預防的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 變異鏈球菌NCTC 10449（首都醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院）；胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基（Trypticase Soy Broth，TSB）、胰蛋白胨大豆肉湯固體培養(yǎng)基 （Trypticase Soy Agar，TSA）（北京陸橋公司）；Wistar雄性大白鼠 （北京大學醫(yī)學部）；HMME （上海復旦張江生物公司）；532nm半導體激光器（中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所）；厭氧培養(yǎng)箱；超凈工作臺（蘇州凈化）；光學顯微鏡（OLYMPUS，日本）

1.2 方 法

1.2.1 變異鏈球菌菌懸液的制備 將變異鏈球菌NCTC 10449，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，取一接種環(huán)（D=1 mm）的細菌劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)48 h。涂片檢查，確定為純培養(yǎng)后，挑取單個典型菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度為 1×108CFU/ml，待用。

1.2.2 大鼠致齲模型的建立和分組處理 將70只均于出生后21 d斷奶的同窩別、同鼠齡Wistar大鼠于22～24 d鼠齡期間喂以抗生素飲用水 （含有青霉素和鏈霉素），于25～27 d鼠齡期間，連續(xù)3 d（1次/d）給幼鼠口腔內(nèi)接種變異鏈球菌（100μl菌液/次），并喂以致齲飼料 2000#［13］（6%全麥粉、56%蔗糖、3%脫水蔬菜粉、28%精煉奶粉、2%食用鹽、1%脫水全肝粉和4%酵母）和菌懸液飲用水，28 d隨機抽取大鼠，檢測口腔內(nèi)細菌是否定植成功（＞108CFU/ml為定植成功）。（查閱到的文獻中所述建模方法及檢測建模是否成功也僅是通過檢測口腔細菌的定植是否成功，尚未見到其他更有效的檢測方法）

建模成功后將大鼠隨機分為以下7組，每組10只，根據(jù)前期預實驗結(jié)果篩選出合適的光照參數(shù)和光敏劑參數(shù)：A 組：17 mW HMME－PDT組；B組：34 mW HMME－PDT 組；C 組：68 mW HMME－PDT組；D組：單純光敏劑組；E組：34 mW單純激光照射組；F組：2 g/L氟化鈉陽性對照組；G組：9 g/L生理鹽水陰性對照組。于29 d將麻醉后的大鼠取仰臥位，按分組情況進行處理。光敏劑HMME用量為40μg/ml，孵育時間為5 min，532 nm的半導體激光距離牙齒表面1 mm垂直照射A、B、C、E組牙齒，照射時間均為 90 s；D、F、G 組分別采用 HMME、2 g/L氟化鈉溶液、9 g/L生理鹽水溶液涂搽大鼠磨牙各面，處理1次/周，連續(xù)4周。

1.2.3 觀察指標 56 d處死大鼠，拔除牙齒后，分組保存在10%中性甲醛溶液中，使用復合酸脫鈣2 W后，進行石蠟包埋，制備厚約5μm的連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，中性樹脂封固，然后在光學顯微鏡下對牙髓組織進行觀察，主要包括出血和炎癥程度兩方面，采用雙盲法對組織學的改變進行評分［14］，評分標準如表1所示。由于實驗條件所限，尚未有針對牙髓組織的量化評估指標，在以后的實驗中會彌補這一不足。

表1 牙髓組織炎癥或出血程度指標

1.2.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 （x±s）表示，應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用秩和檢驗分析各組差異，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

正常牙髓組織無毛細血管擴張、炎癥或出血（圖1a）；D組、F組牙髓組織與G組相比無明顯變化（圖 1b、c）；A 組、B 組激光照射后，牙髓組織均有輕度的毛細血管擴張、充血（圖 1e、f）；C 組、E 組牙髓組織均有大量毛細血管擴張、充血，但并未見炎癥細胞浸潤（圖 1g、d）。

不同實驗組處理后的牙髓組織計分結(jié)果見表2，與G組相比，A組、B組牙髓組織計分沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；C、E 組計分高，有明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.05），但兩組之間計分沒有明顯的統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。隨著PDT功率的增加，牙髓組織炎癥或出血程度計分有所增加。

圖1 不同處理的各組牙髓組織圖

表2 各組大鼠牙髓組織的炎癥或出血程度計分結(jié)果

3 討論

齲病是一種內(nèi)源性感染性疾病，主要致齲菌是變異鏈球菌，它能產(chǎn)生有機酸，使牙體無機物酸蝕脫礦，有機物壞死崩解，最終形成齲齒［15］。變異鏈球菌等多數(shù)致齲菌是 G+，研究表明［16］PDT 對 G+的殺傷效果要強于G－，因此PDT可能通過有效抑制致齲菌的生長而達到防齲的目的。

PDT是一門新技術(shù)，由多個學科（如光物理學、光化學和醫(yī)學等）相互交叉滲透而形成，具有光敏劑、光源和氧三個要素。簡單來說其反應過程是受一定波長激發(fā)的光敏劑在吸收特定能量的光子后從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的光敏劑極不穩(wěn)定，再從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)過程中所引發(fā)的一系列物理和化學反應。反應機制有以下兩種：Ⅰ型：處于激發(fā)態(tài)的光敏劑分子與周圍生物分子發(fā)生氧化還原反應，形成活性氧分子自由基（ROS），或者氧化還原氧分子、水分子形成超氧陰離子、過氧化氫等中介自由基直接殺傷微生物，即自由基的氧化還原反應。Ⅱ型：處于激發(fā)態(tài)的光敏劑分子與氧分子發(fā)生氧化還原反應，生成單線態(tài)氧1O2等有毒物質(zhì)，單線態(tài)氧具有細胞毒性，能夠破壞細胞結(jié)構(gòu)導致微生物死亡［17－19］，兩種機制共同存在，相互競爭，Ⅱ型機制因產(chǎn)生更多的具有細胞毒性的單態(tài)氧成為光動力的主要機制［20］。

多項研究結(jié)果表明［21－23］PDT 可有效抑制定植在人工菌斑生物膜中的變異鏈球菌等細菌的生長和生物膜的形成，有助于減緩齲齒的發(fā)生發(fā)展。孫繼軍等［24－26］研究顯示 PDT抑制大鼠齲齒的效果甚至優(yōu)于氟化鈉，這與本實驗前期結(jié)果相似［23，25］，但 PDT的作用效應與光功率密切相關，而光功率的變化是否會對牙髓組織造成影響是值得研究和探討的。

牙髓組織位于牙髓腔內(nèi)，其血管密集分布，具有豐富的血運系統(tǒng)，周圍被具有不可讓性的牙體組織包繞，其體積變化范圍容許量很小。當激光照射牙體組織時，產(chǎn)生的光熱作用會使牙體溫度升高，若熱量傳導到牙體內(nèi)部，使牙髓組織溫度升高，就會造成牙髓血流增加和血管擴張，從而造成組織壓升高，導致血流減慢和形成血栓，甚至發(fā)生壞死［27］。有研究認為［28］，牙髓溫度升高超過5.6℃時，就會引起牙髓組織的損傷，這個值被認為牙髓溫升的安全極限。Zach等［29］研究發(fā)現(xiàn)牙髓溫度升高超過5.6℃時，會有15%的牙髓喪失活力；達到8.3℃時，約有20%的牙髓喪失活力；達到11.1℃時，有60%的牙髓喪失活力；達到16.6℃時，則所有牙髓均喪失活力。有研究者［30］在Nd：YAG 激光對口腔組織熱效應的研究中發(fā)現(xiàn)，功率的增加會造成牙髓溫度的升高。丁星月等［31］在532 nm摻釹釔鋁石榴石皮秒激光照射離體牙對髓腔溫度的影響研究中發(fā)現(xiàn)，在一定時間下，髓腔溫度隨著功率增加而升高。在該實驗結(jié)果中，牙髓組織的反應也隨著PDT組功率的增加而加重，推測與髓腔溫度升高有關。與生理鹽水對照組牙髓記分相比，除了單純激光照射組和68 mW HMME－PDT組外，其余各組均沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但這兩組間無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。 在照射時間相同時，68 mW HMME－PDT組的牙髓組織病理與其余HMME－PDT組相比，已有大量的毛細血管擴張、充血，牙髓組織記分也已呈現(xiàn)明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。在功率同為34 mW，照射時間均為90 s的條件下，單純激光組的牙髓記分明顯高于 HMME－PDT 組（P＜0.05），出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能與HMME－PDT組照射時產(chǎn)生的熱量少，牙髓組織升溫較少有關；當照射時間相同，功率增大到68 mW時，其產(chǎn)生的熱量仍能造成牙髓溫升高，出現(xiàn)血管擴張和充血（表2）。孫繼軍等［24］在對大鼠齲齒模型光動力的實驗中未發(fā)現(xiàn)牙周組織的損傷，該實驗中大功率的激光照射會造成牙髓組織的損傷，張蕾等［25］研究也證實在功率不變的實驗條件下，照射時間延長，能量密度增加也會損傷大鼠口腔黏膜，造成這一差異的原因是否與光敏劑、光劑量、實驗方式等有關還有待于進一步研究證實。

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