陸英杰，袁 生，鄧玉妹，李君養(yǎng)，柯駿鴻，盧玉葵

（佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231）

豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhuriopathiae）亦稱豬丹毒絲菌或丹毒絲菌，革蘭氏染色陽性，通常呈桿狀，但在心內膜上分離到的病原菌菌體呈絲狀，是一種人獸共患病原菌。該病原菌通常和豬瘟、豬肺疫形成三聯(lián)苗在養(yǎng)豬業(yè)廣泛應用，是養(yǎng)豬業(yè)有久遠歷史的重要病原菌。該病菌可以引起豬的急性和亞急性敗血癥、慢性心內膜炎和關節(jié)炎，也能引起人的類丹毒［1-2］。由于豬瘟-豬肺疫和豬丹毒三聯(lián)苗的存在及抗生素的廣泛應用，該病的防控獲得很好效果，我國已將近20年未見有該病的發(fā)生和報道［3］。但近幾年，豬丹毒舊病新發(fā)，在歐洲、日本和美國曾經暴發(fā)過，而且被分離鑒定的血清型也非常多［4］，與此同時在我國江蘇、湖南、福建、云南等地也有該病暴發(fā)的報道，廣東廣州、佛山、清遠等地的豬只也未能幸免，不僅造成幼齡豬只的急性死亡，同時成年豬只也出現(xiàn)急性和慢性豬丹毒特點，且死亡率不斷升高，給廣東地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失，同時由于耐藥菌株的出現(xiàn)，為防治該病帶來一定的困難［5］。尤其當該病出現(xiàn)，豬只將面臨合并感染而死亡，對養(yǎng)豬業(yè)的潛在危害很大，因此預防并及時防控該病是保障養(yǎng)豬業(yè)順利發(fā)展的關鍵。國內外目前集中于豬丹毒檢測及耐藥菌株基因的檢測［6-7］及滅活苗或與其他病毒病聯(lián)合疫苗的研究［8］，因此及早鑒定該類疾病，深入了解豬丹毒病原菌對豬只造成臟器損傷以及對藥物的耐藥性，及時控制本病的蔓延和侵害是防制和研究的重點。為此，本試驗通過對廣東地區(qū)發(fā)生的豬丹毒桿菌病豬進行病原的分離鑒定，獲得廣東地區(qū)流行的豬丹毒桿菌類型，經16S rRNA通用引物的基因序列鑒定確定其血清型，同時對SPF級BALB/c實驗小鼠進行臨床致病性實驗，觀察該病原菌對小鼠造成的病理損害，對機體免疫應答產生的結果，以了解該病原產生病理損傷的原因；藥物敏感性實驗確定其對哪些藥物的敏感度比較強等，這些科學研究資料可以為進一步研究該病奠定基礎，同時也為臨床防治該病找尋合適的藥物提供有價值的科研資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料采自廣東某地區(qū)疑似豬丹毒病豬的心、肝和腎等器官；實驗動物SPF級BALB/c小鼠（25±0.1 g）購自廣東醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。

主要試劑和儀器：PCR儀；16sRNA通用引物（上海生物工程科技有限公司）；多媒體圖像分析儀（Image-proplus，Media Cybernetics 公司，2005）；IMark 680酶聯(lián)免疫檢測儀（BIORAD公司，2015） ；IgM和IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（南京建成工程研究所）；革蘭氏染色液1套，血液培養(yǎng)瓊脂（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；藥敏試紙片：青霉素G，鏈霉素，氨芐西林，頭孢氨芐，頭孢噻肟，林可霉素，頭孢克肟，阿奇霉素，恩諾沙星（規(guī)格：10 μg/片，廣州吉祥生物科技有限公司）

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離及形態(tài)學特性觀察 參照文獻［9］方法，將疑似豬丹毒桿菌的病豬進行心、肝、腎組織分離后在無菌條件下劃線于血液瓊脂平板和半固體培養(yǎng)基，將獲得的菌落進行涂片染色鏡檢，記錄細菌形態(tài)特征。保種，放于-20℃冰箱保存。

1.2.2 16S rRNA核苷酸序列鑒定及進化樹分析 參照文獻［10-11］使用能夠擴增大多數(shù)細菌16 S rRNA 基因的通用引物，上游引物：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGCTACCT TGTTACGACTT-3′，對所獲的基因片段進行測序，將所獲得序列進行Blast比對，并應用DNAstar軟件的Multiple Sequence Aligment程序進行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建。

1.2.3 動物感染試驗 應用30只BALB/c小鼠進行感染試驗，通過飲水口服方法對小鼠進行慢性感染，攻毒菌液濃度為107CFU/mL，觀察小鼠臨床變化，1周后眼球采血離心取血清置-20℃?zhèn)溆茫惶幩啦⑵蕶z感染小鼠觀察肝臟和脾臟等的臨床病理變化，同時采取小鼠的肝臟和脾臟進行中性甲醛固定，制作石蠟切片，H.E染色方法觀察這些臟器的組織病理變化。

1.2.4 ELISA檢測小鼠IgM和IgG抗體 應用ELISA檢測試劑盒對試驗小鼠進行血清中IgM和IgG的檢測，方法參照試劑盒使用說明進行。

1.2.5 藥敏性檢測 采用藥敏紙片擴散法，將通過細菌的表型特征觀察以及引物擴增并測序比對后鑒定的5株菌進行血清肉湯培養(yǎng)，調整菌液濃度為107CFU/mL，然后將菌液均勻涂布在血液瓊脂平板上，貼上藥敏試紙片，37℃培養(yǎng)

24 h，測量抑菌圈大小并判定結果。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離與16S rRNA的鑒定

臨床診斷疑似豬丹毒桿菌的病豬的肝、腎和脾進行血液瓊脂平板的分離培養(yǎng)鑒定，獲得5株優(yōu)勢細菌，均形成針尖樣大小的灰白色菌落，不溶血，革蘭氏染色呈陽性桿菌，經過16S rRNA通用引物基因序列鑒定后確定均為豬丹毒桿菌，這5株菌分別命名為GZSs1、GZSq1、GZSs2、GZSj1、GGZSs。應用MEGA6軟件分析5株菌與已報道的具有完全基因序列的兩株豬丹毒桿菌GXBY-1和SY027兩株菌進行親源關系的分析。分離菌株16S rRNA的PCR產物電泳結果和基因進化樹分別見圖1和圖2。

圖1 分離菌株16S rRNA的PCR產物電泳結果

由圖2可知，與已知GXBY-1和SY1027兩個豬丹毒菌株相比，本研究分離獲得的5株豬丹毒桿菌盡管在Blast比對中其親源關系非常近，但它們在進化方面還是有明顯不同，其中a株和c株菌兩個進化關系相近，而d株與已知的GXBY-1株進化關系相近，b株和e株與其他菌株進化關系則有很大差異。

圖2 5株分離菌與報道已知菌的基因進化關系樹

2.2 ELISA檢測小鼠血清中IgM和IgG的結果

對照組小鼠抗體IgM含量為30.63（±8.09）ng/mL，與攻毒組IgM含量（116.03±22.83 ng/mL）相比差異顯著，對照組小鼠抗體IgG含量為21.11（±10.34）ng/mL，與攻毒組IgG含量（103.03±15.65 ng/mL）相比差異顯著。顯示口服致病小鼠盡管發(fā)病比較緩慢，但機體對病原刺激產生的抗體動力學規(guī)律是一樣的。

2.3 感染小鼠肝臟和脾臟的病理變化

2.3.1 豬丹毒感染小鼠肝臟的病理變化結果 從圖3（封三）可以看出，對照組肝臟的肝板結構整齊，膽管與血管集中地方界限清晰，肝細胞有代謝增生但沒有空泡樣變性和壞死；而感染組肝臟的肝板結構紊亂，肝細胞出現(xiàn)黃型的空泡樣變性和壞死現(xiàn)象，肝細胞腫脹，核碎裂、核消失現(xiàn)象非常明顯。

圖3 豬丹毒感染小鼠肝臟的病理變化結果（H.E×400）

2.3.2 豬丹毒感染小鼠脾臟的病理變化結果 圖4（封三）顯示，對照組脾小體結構清楚，紅髓和白髓間隙清晰可見，結構完整，無鐵紅素顆粒沉積；感染組脾小體結構紊亂，紅白髓結構紊亂混雜，淋巴細胞出現(xiàn)變性壞死現(xiàn)象；而且有鐵紅素顆粒沉積，顯示黑色顆粒堆積的地方均為沉積的鐵紅素顆粒。

圖4 豬丹毒感染小鼠脾臟的病理變化結果（H.E×400）

2.4 藥敏檢測試驗結果

9種藥物對鑒定的5株菌藥物敏感性試驗結果見表1。從表1可以看出，a株、d株和e株菌對鏈霉素和林可霉素不敏感，對阿奇霉素和恩諾沙星中度敏感，對頭孢克肟高度敏感，對青霉素和氨芐西林極度敏感；而b株和c株菌對林可霉素不敏感，對鏈霉素和恩諾沙星中度敏感，對青霉素、頭孢氨芐、頭孢噻肟和氨芐西林均極度敏感，但兩株菌對阿奇霉素的表現(xiàn)不同，c株菌對阿奇霉素呈現(xiàn)極度敏感，對頭孢克肟高度敏感；但b株菌對阿奇霉素表現(xiàn)中度敏感，對頭孢克肟極度敏感。此種情況提示菌株對藥物的抵抗性有一定的差異。

表1 5株菌藥物敏感性試驗結果（mm）

3 結論與討論

3.1 豬丹毒桿菌對小鼠的感染

豬丹毒桿菌鑒定后，對SPF級小鼠進行口服感染，通過感染發(fā)現(xiàn)小鼠對豬丹毒桿菌的感染具有一定的抵抗力，口服7 d內與對照組相比，感染組進食較多和排泄糞便有細微的變化之外，其他并未出現(xiàn)明顯的癥狀，口服7 d后處死小鼠，解剖發(fā)現(xiàn)心臟心肌變性，肝臟和脾臟有不同程度的壞死點和壞死區(qū)域，與臨床上致死豬只的心臟和肝臟變化一致，證明該病菌的致病性?？诜腥九c報道中腹腔注射不相同［12］，口服易受到消化系統(tǒng)的影響，但該病原可通過消化道、呼吸道以及環(huán)境污染物引起易感動物感染，而且在嚙齒類動物中也可分離到該菌，可見，小鼠既可以感染也可以是該病原的帶菌傳播者，感染的實驗動物呈心內膜炎型［13］，而在實驗中證實了這些觀點，同時在剖檢中發(fā)現(xiàn)小鼠肝脾也出現(xiàn)變性、壞死、充血、出血等問題，但小鼠在臨床上并無典型癥狀表現(xiàn)，顯示小鼠是養(yǎng)豬業(yè)豬丹毒桿菌的重要傳播者，尤其是經口服感染的小鼠危害性可能更大。

3.2 豬丹毒對小鼠肝脾以及IgM和IgG的影響

通過小鼠致病性實驗，觀察到該病不僅對心臟造成壞死性影響，而且對肝臟和脾臟也造成損傷，經過病理觀察顯示該細菌肝脾造成的損傷，尤其是脾臟，它是免疫應答的場所，紅髓和白髓的損傷會嚴重影響免疫細胞對免疫應答的產生，ELISA檢測的IgM和IgG的濃度顯示減少的B淋巴細胞參與體液免疫，而且脾臟紅髓在病理觀察中顯示損傷嚴重。此外，致病性實驗是通過口服進行的，豬丹毒桿菌雖然經過小鼠胃蛋白酶和酸性作用，但仍能刺激機體產生中和抗體，而且其動力學規(guī)律仍然符合初次免疫應答的規(guī)律，說明本試驗獲得的豬丹毒桿菌與文獻中闡述的耐酸性能好是一致的，且有很強的致病性［14］。

3.3 豬丹毒對藥物的敏感性

本試驗獲得5株豬丹毒桿菌，均來自于廣東佛山某些地區(qū)。通過藥敏片實驗發(fā)現(xiàn)，這5株菌均對青霉素和氨芐西林極度敏感，對鏈霉素有不同反應；GZSs1、GZSj1、GGZSs這3株菌對鏈霉素不敏感，但GZSq1、GZSs2兩株菌對鏈霉素表現(xiàn)中度敏感，該實驗結果與20年前文獻報道的MIC方法進行豬丹毒桿菌的藥物敏感性實驗具有一致性［15-16］，盡管MIC方法比藥敏片方法更為準確但也顯示出豬丹毒桿菌的進化對抗生素的敏感性。從本試驗基因進化分析的圖譜中發(fā)現(xiàn)，5株菌基因進化親源性存在差異，暗示其對抗生素的敏感度會有所不同。在頭孢噻肟、頭孢克肟、林可霉素、阿奇霉素及恩諾沙星等抗生素的藥物敏感性實驗中，說明基因進化分析的可能，本試驗發(fā)現(xiàn)5種菌株對頭孢噻肟和恩諾沙星的重度和中度敏感與文獻報道安徽菌株的藥敏結果有所不同［11，16］，但對林可霉素的耐藥性方面有一致的實驗結果［5］。豬丹毒桿菌的耐藥性不僅與基因進化有關，與生長環(huán)境等也有一定關系。

本試驗通過分離培養(yǎng)和16sRNA基因序列鑒定獲得5株豬丹毒桿菌，進化分析顯示出同源性差異；對SPF級小鼠進行攻毒試驗后，可以刺激機體產生IgM和IgG抗體，產生含量與空白對照差異顯著；該菌嚴重損傷肝臟和脾臟，常規(guī)病理學變化顯示肝臟和脾臟細胞均有不同程度的變性和壞死，脾臟紅髓和白髓部分地方有鐵紅素沉積；藥物敏感性試驗證明5株菌對林可霉素均不敏感，部分對鏈霉素也不敏感；均對青霉素，氨芐西林和頭孢噻肟極度敏感，對頭孢氨芐重度敏感，阿奇霉素、恩諾沙星中度敏感顯示臨床上可以使用這兩種藥物進行治療。

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