王永強(qiáng)，王 珺

（海南大學(xué)海洋學(xué)院/熱帶生物資源教育部重點(diǎn)試驗室/海南大學(xué)海洋生物試驗教學(xué)中心，海南 ?？?570228）

錘狀中鼓藻〔Bellerochea malleus（Brightwell）Van Heurek〕屬硅藻門、中心綱、盒形藻目、盒形藻科、中鼓藻屬，可以作為水產(chǎn)動物的優(yōu)良餌料，還可以凈化養(yǎng)殖水環(huán)境。目前，國內(nèi)外有關(guān)中鼓藻的研究較少，楊聽林等［1］研究了中鼓藻的光控發(fā)育研究，林均民等［2］研究了中鼓藻三類大小細(xì)胞的生化組成，楊世民等［3］研究了中國海域浮游硅藻鐘形中鼓藻（Bellerochea horologicalisStosch）與錘狀中鼓藻的重要區(qū)別，部分調(diào)查文獻(xiàn)記載了鼓藻［4-6］。微藻的規(guī)?；囵B(yǎng)是其開發(fā)利用的前提，而溫度、光照、鹽度等生態(tài)因子與微藻的生長繁殖密切相關(guān)。因此篩選出微藻適宜及最適的生態(tài)因子是提高藻細(xì)胞密度關(guān)鍵的第一步。此外，微藻的生長繁殖與氮、磷、鐵、硅等營養(yǎng)鹽密切相關(guān)，即藻類對營養(yǎng)鹽的需求有適宜及最適的種類及濃度。因此，越符合藻營養(yǎng)需求的配方，越能獲得較理想的培養(yǎng)效果。

我們前期在海南省熱帶海域分離獲得1株生長速度快、抗污染能力強(qiáng)的耐高溫錘狀中鼓藻。為了提高該藻的生長速率，獲得較高的生物質(zhì)產(chǎn)量，筆者研究了該藻主要生態(tài)因子（溫度、光照、鹽度）的適宜及最適范圍，并分別通過氮、磷、鐵、硅等礦質(zhì)營養(yǎng)元素以及維生素B1（VB1）、維生素B12（VB12）和維生素H （VH）等維生素正交實驗，優(yōu)化其培養(yǎng)基配方，以期為今后人工大規(guī)模培養(yǎng)錘狀中鼓藻提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

錘狀中鼓藻取自海南大學(xué)海洋學(xué)院藻種室，原種于2016年2月采自海南省陵水縣新村港自然海區(qū)，經(jīng)分離純化得到。藻體細(xì)胞環(huán)面觀呈扁帶狀，寬100 μm左右，為長且直的群體，相連細(xì)胞之間僅在鏈的兩側(cè)出現(xiàn)近菱形的小間隙［7］。在電鏡下，細(xì)胞角處殼面與殼套之間生有邊緣突［8］。試驗前接種到1 000 mL三角瓶中活化純培養(yǎng)，不充氣，每天早上、中午、晚上各搖動1次，取指數(shù)生長期的藻株進(jìn)行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 藻體培養(yǎng) 培養(yǎng)用的海水取自海口市美蘭區(qū)白沙門海域，經(jīng)濾袋及脫脂棉過濾，煮沸、自然冷卻后使用。海水鹽度為31.5，pH 值為8.03。試驗培養(yǎng)瓶選用150 mL三角瓶，經(jīng)洗液洗滌、晾干，120℃恒溫消毒2 h。各試驗組溫度控制在25（±1）℃（除溫度試驗外），光強(qiáng)3 000（±200） lx（除光照試驗外），光周期為14L∶10D，培養(yǎng)時間為4 d。每天早上、中午、晚上各搖動1次，并隨機(jī)交換培養(yǎng)瓶位置，以減少照度差異。本試驗的培養(yǎng)液均采用添加5.0 mg/L Na2SiO3的“寧波大學(xué)3#培養(yǎng)液”配方［9］。

1.2.2 試驗設(shè)計 生長曲線測定：在光照恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，接種密度為11.54×104cells/mL，溫度為25（±1）℃，光照為2 000 lx，每天定時計數(shù)，培養(yǎng)7 d。

生態(tài)單因子試驗：設(shè)溫度試驗梯度（15、20、25、30、35℃），培養(yǎng)瓶置于光照恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，接種密度15.38×104cells/mL；設(shè)光照試驗梯度（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 lx），培養(yǎng)瓶置于暗室培養(yǎng)架上，通過調(diào)節(jié)試驗瓶與光源的距離來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，接種密度為11.54×104cells/mL；設(shè)鹽度試驗梯度（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55），分別用淡水、鹽度為30及60的培養(yǎng)液調(diào)配至所需要的鹽度，接種密度為15.4×104cells/mL。各試驗均設(shè)置2個水平試驗。

礦質(zhì)營養(yǎng)鹽的正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行礦質(zhì)營養(yǎng)鹽的正交試驗，參照正交試驗法［10］，選用 L18（35）設(shè)計（表1），接種藻細(xì)胞密度為9.23×104cells/mL，溫度為25（±1）℃，光照為2 000 lx，培養(yǎng)4 d后計數(shù)。

表1 營養(yǎng)鹽正交試驗因素水平

維生素正交試驗：維生素B1（VB1）、維生素B12（VB12）及生物素（VH）3因子4水平的正交試驗設(shè)計參照正交試驗法［10］，選用L16（43）設(shè)計（表2），接種藻細(xì)胞密度為 9.23×104cells/mL，溫度為25（±1）℃，光照為2 000 lx，進(jìn)行試驗，培養(yǎng)4 d后計數(shù)。

1.2.3 藻細(xì)胞密度的測定 先用血球計數(shù)板（計數(shù)藻細(xì)胞密度）及可見分光光度計（測定藻液OD值）測出藻細(xì)胞密度與藻液OD值（A420，培養(yǎng)液為空白）的線性關(guān)系；測定試驗藻液的OD值，根據(jù)藻細(xì)胞密度與OD值的線性關(guān)系換算出試驗藻液的藻細(xì)胞密度。

表2 維生素正交試驗因素水平

1.2.4 生長速率的計算 藻細(xì)胞的生長速率K由以下公式計算：K=（lnXt- lnX0）/t

式中，Xt為經(jīng)過t時間培養(yǎng)后的藻細(xì)胞密度，X0為起始藻細(xì)胞密度，t為培養(yǎng)時間（d）。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，并使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（方差分析、LSD多重比較）。

2 結(jié)果與分析

2.1 錘狀中鼓藻的生長曲線

從錘狀中鼓藻的生長曲線（圖1）可見，接種后第1 天藻細(xì)胞密度變化很小，屬于延緩期；接種后第2天就進(jìn)入指數(shù)生長期，藻細(xì)胞密度直線上升，持續(xù)時間達(dá)3 d，然后進(jìn)入相對生長下降期，藻細(xì)胞密度繼續(xù)生長，生長速率相對指數(shù)生長期有所減慢。

圖1 錘狀中鼓藻的生長曲線

2.2 錘狀中鼓藻培養(yǎng)的生態(tài)單因子試驗結(jié)果

圖2 溫度對錘狀中鼓藻生長的影響

2.2.1 溫度試驗 從圖2可知，錘狀中鼓藻在溫度為15～35℃范圍內(nèi)均可生長，溫度在15～30℃范圍內(nèi)，藻細(xì)胞的K值隨著溫度的增加而加大，30℃時達(dá)最大值，即30℃為最佳溫度。溫度在30～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，藻細(xì)胞的K值越來越小。方差分析結(jié)果表明，溫度對錘狀中鼓藻生長影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 光照試驗 從圖3可知，錘狀中鼓藻在1 000～8 000 lx光照條件下均可生長，在光強(qiáng)為1 000～4 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強(qiáng)的增加，藻細(xì)胞的K值越來越大，4 000 lx時達(dá)最大。光強(qiáng)在4 000～5 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強(qiáng)的增加，藻細(xì)胞的K值越來越小，光強(qiáng)在5 000～7 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強(qiáng)的增加，藻細(xì)胞的K值幾乎無變化，當(dāng)光強(qiáng)達(dá)8 000 lx時，藻細(xì)胞的K值減小。方差分析結(jié)果表明，光強(qiáng)對錘狀中鼓藻生長影響極顯著（P＜0.01）。

圖3 光照對錘狀中鼓藻生長的影響

圖4 鹽度對錘狀中鼓藻生長的影響

2.2.3 鹽度試驗 從圖4可知，錘狀中鼓藻在鹽度為5～50范圍內(nèi)均可生長，在鹽度為5～35時，藻細(xì)胞的K值隨著鹽度的增加而加大，鹽度為35時最大。在鹽度為35～50時，藻細(xì)胞的K值隨著鹽度的增加而減小，鹽度為55時K值為0。方差分析結(jié)果表明，鹽度對中鼓藻生長的影響極顯著（P＜0.01）。

2.3 錘狀中鼓藻培養(yǎng)的礦質(zhì)營養(yǎng)正交試驗結(jié)果

錘狀中鼓藻培養(yǎng)的礦質(zhì)營養(yǎng)元素正交試驗結(jié)果見表3，對K值進(jìn)行直觀分析和多重比較，結(jié)果表明，試驗號5的組合對中鼓藻培養(yǎng)效果最好，即 NaNO3-N、NaH2PO4-P、FeSO4-Fe、Na2SiO3-Si和Na2MoO4質(zhì)量濃度分別為20.0、1.0、0.1、15.0、0.02 mg/L。

表3 錘狀中鼓藻培養(yǎng)的礦質(zhì)營養(yǎng)的正交試驗結(jié)果

2.6 錘狀中鼓藻培養(yǎng)的維生素正交試驗結(jié)果

錘狀中鼓藻培養(yǎng)的維生素正交試驗結(jié)果見表4，對K值進(jìn)行的直觀分析和多重比較，結(jié)果表明，試驗號5的組合（VB1、VH濃度分別為1.0、0.05 mg/L）對錘狀中鼓藻培養(yǎng)效果最好，其次為9號組合（VB1、VH濃度分別為10.0、0.5 mg/L）。 VB12試驗效果不理想。

3 結(jié)論與討論

溫度、光照、鹽度、礦質(zhì)營養(yǎng)和有機(jī)營養(yǎng)是影響浮游植物光合作用的重要環(huán)境因子。這些環(huán)境因子的影響效應(yīng)主要表現(xiàn)在浮游植物是否可以生長繁殖以及生長繁殖的速度。在錘狀中鼓藻的培養(yǎng)過程中，不僅要注意控制生態(tài)因子，而且要合理選擇營養(yǎng)鹽種類及其濃度，才能獲得理想的培養(yǎng)效果。

表4 維生素的正交試驗結(jié)果

3.1 溫度

溫度是微藻生長繁殖極重要的生態(tài)因子之一，微藻的最適溫度范圍因種類不同而有所差異［9］。有研究者認(rèn)為，溫度對海洋微藻的生長和發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，對酶的活性、營養(yǎng)物的吸收利用效率及細(xì)胞分裂周期等諸多方面都存在不同程度的影響［11］。大多數(shù)微藻的適溫范圍較寬，如小新月菱形藻（Nitzschia closteriumf.minu-tissima）生長的適宜溫度為 10～25℃，最適溫度為 20℃［12］。角毛藻（Chaetocerossp.）、小環(huán)藻（Cyclotellasp.）和直鏈藻（Melosirasp.）的最適溫度分別為 22.3、20.6、24.7℃［13］。本試驗結(jié)果表明，錘狀中鼓藻在15～35℃的溫度范圍內(nèi)均能正常進(jìn)行生長繁殖，為其生長的適宜溫度，30℃時藻細(xì)胞的K值最大，為其最適溫度。可見，錘狀中鼓藻最適溫度相對其他藻類較高，適合海南夏季培養(yǎng)。

3.2 光照

對于光能自養(yǎng)的藻類，光強(qiáng)要超過光補(bǔ)償點(diǎn)，藻類的生物量才有可能增加［14］。不同的藻類，各有其適宜的光強(qiáng)。微小小環(huán)藻（Cyclotella caspia）適宜光強(qiáng)為500～10 000 lx，最適光強(qiáng)為 2 000～8 000 lx［15］；日本星桿藻（Asterionella japonica）生長繁殖適宜光強(qiáng)為500～8 000 lx，最適光強(qiáng)為1 000 lx［16］。本試驗結(jié)果表明，錘狀中鼓藻生長繁殖的適宜光強(qiáng)為1 000～8 000 lx，在光強(qiáng)為1 000～4 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強(qiáng)的增加，藻細(xì)胞的K值越來越大，在光強(qiáng)達(dá)到4 000 lx時，K值最大。光強(qiáng)在4 000～8 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強(qiáng)的增加，藻細(xì)胞的K值越來越小，這是微藻在過強(qiáng)的光照條件下出現(xiàn)了光抑制的原因［9］。

3.3 鹽度

不同微藻對環(huán)境鹽度變化的適應(yīng)能力不同，角毛藻、小環(huán)藻和直鏈藻的最適鹽度分別為12.6、6.1和6.7［13］。微小小環(huán)藻生長的適宜鹽度為 2～85，最適鹽度為 25～50［15］。本試驗結(jié)果表明，錘狀中鼓藻在鹽度為5～50的范圍內(nèi)，均能夠正常生長繁殖，最適鹽度為35。

3.4 礦質(zhì)元素

微藻需要從外界吸收無機(jī)礦質(zhì)元素來制造有機(jī)物［17］。氮是微藻生長最重要的大量元素之一，通常以硝酸鈉或尿素為氮源，不同種類的微藻所需的最佳氮質(zhì)量濃度各異。羅曉霞等［18］研究表明，斜生柵藻在氮濃度為 247 mg/L 時生長速率達(dá)到最高值，之后隨著氮濃度的繼續(xù)增加而下降。三角褐指藻誘變株生長需要最佳的氮濃度為20 mg/L［19］。本研究結(jié)果表明，錘狀中鼓藻最佳的氮質(zhì)量濃度為20 mg/L。磷也是微藻生長所需大量元素之一，藻體對磷的吸收受到環(huán)境影響，在二氧化碳缺乏的情況下，光照能促進(jìn)磷的吸收，氮和磷有相互約束和促進(jìn)的關(guān)系。鐵作為藻類生長發(fā)育所必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，鐵對不同藻類生長的生態(tài)學(xué)效應(yīng)各不相同。三角褐指藻誘變株生長需要最佳的鐵濃度為0.5 mg/L［19］。本研究結(jié)果表明，錘狀中鼓藻最佳的鐵濃度為0.1 mg/L。硅是硅藻必需的營養(yǎng)元素，除了作為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分外，還參與光合色素、蛋白質(zhì)、DNA 的合成和細(xì)胞分裂等多種代謝和生長過程［20］。單種營養(yǎng)鹽沒有辦法滿足微藻的正常生長，營養(yǎng)鹽對微藻的生長影響不是獨(dú)立的，而是相互作用的。通過正交試驗結(jié)果表明，錘狀中鼓藻培養(yǎng)效果最佳的礦質(zhì)元素組合為：NaNO3-N、NaH2PO4-P、FeSO4-Fe、Na2SiO3-Si和Na2MoO4質(zhì)量濃度分別為 20.0、1.0、0.1、15.0、0.02 mg/L。

3.5 維生素

維生素對微藻生長的影響因種類而異。宋邦興等［21］研究表明，翼繭形藻（Amphiprora alata）生長繁殖最適的維生素為0.1 mg/L VB1和0.05 mg/L VB12。季祥等［22］研究表明，擬微綠球藻（Nannochloropsis）生長繁殖最適的維生素為 0.005 mg/L VB1、0.00025 mg/L VB12和 0.00025 mg/L 生物素。本試驗結(jié)果表明，VB1和生物素的濃度分別為1.0和0.05 mg/L時，錘狀中鼓藻的培養(yǎng)效果最好。

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