韓吉思，方小榮，申禮鳳，李建波，姚 茜，楊 梅

（1.廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西國(guó)有高峰林場(chǎng)，廣西 南寧 530002）

近年來(lái)，杉木組織培養(yǎng)技術(shù)在工廠化育苗中已經(jīng)得到一定范圍內(nèi)的應(yīng)用，但杉木人工造林仍以種子繁殖的實(shí)生苗為主，無(wú)性系幼苗在造林中的應(yīng)用還較少，且杉木種子生產(chǎn)常受到氣候及大小年等因素的影響，導(dǎo)致優(yōu)良種子的產(chǎn)量波動(dòng)較大［1］，嚴(yán)重制約著杉木人工林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng)。而利用無(wú)性繁殖技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量遺傳基因型一致的優(yōu)良苗木，既可以彌補(bǔ)杉木傳統(tǒng)育種的缺陷，又可以充分發(fā)掘優(yōu)良遺傳材料的遺傳潛能，有利于商業(yè)化生產(chǎn)。很多科研人員在杉木組培方面做了大量探索，尤其在杉木愈傷組織培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、組培苗誘導(dǎo)生根等方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)步［2-3］。韋如萍等［4］研究了植物生長(zhǎng)激素對(duì)杉木組培苗增殖和生根的影響，結(jié)果表明以MS+NAA 0.05 mg/L + 6-BA 0.3 mg/L +瓊脂7 g/L +蔗糖30 g/L較適宜增殖培養(yǎng)，1/2MS + IBA 0.7 mg/L +瓊脂7 g/L +蔗糖25 g/L適宜生根培養(yǎng)。李峰卿等［5］對(duì)杉木組培體系進(jìn)行優(yōu)化，其增殖倍數(shù)達(dá)到4.19，同時(shí)發(fā)現(xiàn)去除頂芽的外植體較之帶頂芽的外植體在接種后增殖倍數(shù)有所提高。黃娟［6］研究指出，不同杉木外植體的表面滅菌效果存在明顯差異，0.1% HgCl2處理10 min有利于下胚軸、子葉、未成熟胚和莖段4種外植體的滅菌。徐圓圓［7］、周錦業(yè)［8］研究了復(fù)配LED光質(zhì)對(duì)杉木組培苗的影響，指出不同光質(zhì)和光周期會(huì)產(chǎn)生不同效應(yīng)。

紅心杉〔Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.〕是杉木的特殊變異類型，屬杉科杉屬植物，喜生于氣候溫暖、降雨量多、濕度大、光照時(shí)間短的陰涼山區(qū)，具有抗逆性高、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、樹(shù)干圓直、紋理細(xì)密、堅(jiān)韌耐腐等特征，且紅心比率高、色澤獨(dú)特、芳香，廣泛分布于我國(guó)亞熱帶地區(qū)［9-10］。已有學(xué)者在紅心杉組培方面進(jìn)行了研究，如江香梅等［11］以紅心杉優(yōu)良無(wú)性系基部萌條為外植體建立了組培高效繁育體系。陳振科等［12］以紅心杉優(yōu)良單株組培苗為材料，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗生長(zhǎng)和內(nèi)源激素含量的影響。本試驗(yàn)將基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素苯基噻二唑基脲（TDZ）濃度及天然復(fù)合物香蕉汁濃度進(jìn)行搭配組合，篩選最優(yōu)的紅心杉組培苗增殖培養(yǎng)條件，以期為進(jìn)一步優(yōu)化紅心杉組培技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅心杉組培外植體材料取自廣西賀州市八步區(qū)16年生紅心杉林分的優(yōu)樹(shù)，以在廣西大學(xué)組培室繼代培養(yǎng)的第12代生長(zhǎng)一致的組培繼代瓶苗為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用基本培養(yǎng)基、TDZ濃度、香蕉汁濃度3個(gè)因素。其中，基本培養(yǎng)基設(shè)MS、3/4MS和1/2MS 3個(gè)處理，TDZ濃度設(shè)0、0.2、0.4 mg/L 3個(gè)水平，香蕉汁濃度設(shè)0、100、200 g/L 3個(gè)水平（表1）。各因素隨機(jī)排列，進(jìn)行正交試驗(yàn)。香蕉汁制備方法是按不同試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別稱取所需的香蕉量（質(zhì)量體積比，W/V），搗爛后放入燒杯中，加入500 mL蒸餾水，置于電爐上加熱至沸騰，然后用微火保持微沸20～30 min，過(guò)濾，去渣取汁作配制培養(yǎng)基用［13］。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

根據(jù)表1配制9個(gè)處理的培養(yǎng)基，分裝至培養(yǎng)瓶，每瓶40 mL，貼好標(biāo)簽，連同用報(bào)紙包裹好的鑷子、解剖刀、不銹鋼盤、蒸餾水等置于高壓蒸汽滅菌鍋，121℃下滅菌，接種環(huán)境以紫外燈滅菌30 min，酒精擦拭超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)上，將無(wú)菌發(fā)芽的健壯組培苗切除愈傷組織后切成約1.5 cm的莖段，接種于培養(yǎng)基上，每瓶6個(gè)莖段，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種15瓶。將接種好的材料置于光照培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度24（±3）℃、光周期12 h/d、光照強(qiáng)度1 500 lx，30 d后統(tǒng)計(jì)組培苗的葉芽數(shù)并計(jì)算其增殖系數(shù)，準(zhǔn)確稱取杉木組培苗葉片并剪碎，測(cè)定葉綠素和可溶性糖含量。其中，增殖系數(shù)=總芽數(shù)/接種時(shí)芽數(shù)，葉綠素含量采用丙酮乙醇提取法［14］測(cè)定，可溶性糖含量采用蒽酮濃硫酸法［15］測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件處理并進(jìn)行極差分析，采用SPSS軟件［16］對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較。由于各指標(biāo)在不同處理間的表現(xiàn)存在差異，單一指標(biāo)難以全面客觀地反映不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的育苗效果［17］，因此，本試驗(yàn)采用多維空間（歐幾米德）En綜合評(píng)定法對(duì)各處理培養(yǎng)基進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［18］，以避免指標(biāo)間相關(guān)性的影響和覆蓋。具體方法如下：將所需評(píng)定的3個(gè)指標(biāo)按9個(gè)處理列出原始數(shù)據(jù)表；在每一指標(biāo)中選出最大值作標(biāo)準(zhǔn)值，并令其等于1，再將這一指標(biāo)其他數(shù)值除以該指標(biāo)中的最大值，所得的商填入矩陣坐標(biāo)表；通過(guò)以下公式計(jì)算矩陣坐標(biāo)表中各列數(shù)值與其他標(biāo)準(zhǔn)值商的離差平方和：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)紅心杉組培苗增殖系數(shù)的影響

從表2可以看出，在2號(hào)培養(yǎng)基（A1B2C2）中，紅心杉組培苗的增殖系數(shù)最高、達(dá)2.72，顯著高于其他處理，增殖系數(shù)最低的是8號(hào)培養(yǎng)基（A3B2C1）、僅1.72，前者是后者的1.6倍。各因素對(duì)增殖系數(shù)影響的大小表現(xiàn)為基本培養(yǎng)基＞香蕉汁濃度＞TDZ濃度，紅心杉組培苗的增殖系數(shù)隨著基本培養(yǎng)基濃度的增加呈上升趨勢(shì)，適量濃度的TDZ和香蕉汁對(duì)增殖培養(yǎng)都有一定的促進(jìn)作用，但是濃度過(guò)大時(shí)反而有抑制作用。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)紅心杉組培苗增殖系數(shù)的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)紅心杉組培苗葉綠素含量的影響

由表3可知，紅心杉組培苗在7號(hào)培養(yǎng)基（A3B1C3）中葉綠素含量最高（2.53 mg/g），顯著高于除4號(hào)外的其他培養(yǎng)基處理，是葉綠素含量最低的2號(hào)培養(yǎng)基（A1B2C2、1.71 mg/g）的1.5倍。影響紅心杉組培苗葉綠素含量的3個(gè)因素依次為基本培養(yǎng)基＞TDZ濃度＞香蕉汁濃度。TDZ和香蕉汁濃度提高時(shí)葉綠素含量呈上升趨勢(shì)。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)紅心杉組培苗可溶性糖含量的影響

紅心杉組培苗可溶性糖含量最高的處理是1號(hào)培養(yǎng)基（A1B1C1）、為33.84 mg/g，與6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)培養(yǎng)基存在顯著差異，最低的9號(hào)培養(yǎng)基（A3B3C2）的可溶性糖含量?jī)H20.68 mg/g（表4）。對(duì)紅心杉組培苗可溶性糖含量的影響大小表現(xiàn)為基本培養(yǎng)基＞TDZ濃度＞香蕉汁濃度。基本培養(yǎng)基和香蕉汁濃度增加時(shí)可溶性糖含量都呈上升趨勢(shì)，TDZ濃度增加時(shí)可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)紅心杉組培苗葉綠素含量的影響

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)紅心杉組培苗可溶性糖含量的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)紅心杉組培苗增殖效果的坐標(biāo)綜合評(píng)定

從表5可以看出，在9個(gè)處理中，4號(hào)培養(yǎng)基的紅心杉組培苗各個(gè)指標(biāo)都處于較高水平、增殖效果最好，∑Pi2值為0.0108；5號(hào)培養(yǎng)基效果第二；2號(hào)培養(yǎng)基對(duì)組培苗增殖系數(shù)的作用最好；7號(hào)培養(yǎng)基對(duì)葉綠素含量的影響最佳；1號(hào)培養(yǎng)基對(duì)可溶性糖含量的影響最佳。綜合評(píng)定認(rèn)為，紅心杉組培苗的最佳增殖培養(yǎng)條件為3/4MS+香蕉汁100 g/L。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基組合下紅心杉組培苗的增殖系數(shù)、葉綠素含量、可溶性糖含量相差較大。培養(yǎng)基在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起到不可替代的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分，也是影響次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因素之一［19］，植物組織培養(yǎng)成功與否，一方面取決于培養(yǎng)材料自身的性質(zhì)，另一方面也取決于培養(yǎng)基的種類和成分，不同的植物材料對(duì)培養(yǎng)基的要求不同，因而必須根據(jù)植物材料和培養(yǎng)目的的不同選擇合適培養(yǎng)基，并按照不同的培養(yǎng)階段加入適當(dāng)?shù)奶砑游铩?/p>

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)紅心杉組培苗增殖效果的坐標(biāo)綜合評(píng)定

MS培養(yǎng)基是組培技術(shù)應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基質(zhì)，具有較高的増殖效果［20］。莫雅芳等［21］以杉木優(yōu)良樹(shù)種基部莖段為材料，在1/2MS+IBA 0.3 mg/L+6-BA 0.4 mg/L中培養(yǎng)25 d后腋芽增殖倍數(shù)較高。楊家鴻［22］研究認(rèn)為，MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L適宜紅心杉誘導(dǎo)培養(yǎng)。呂杰等［23］在研究基因型及基本培養(yǎng)基對(duì)玉米成熟胚培養(yǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基更適合多數(shù)基因型的玉米愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。秦獻(xiàn)泉等［24］以荔枝和龍眼莖段為外植體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基更適合荔枝和龍眼莖段芽的誘導(dǎo)。姜殿強(qiáng)等［25］研究表明，對(duì)鐵皮石斛莖段叢生芽的增殖培養(yǎng)而言，MS培養(yǎng)基優(yōu)于1/2MS、B5和N6培養(yǎng)基。本研究也發(fā)現(xiàn)，基本培養(yǎng)基是影響紅心杉組培苗增殖培養(yǎng)的最主要因素，而3/4MS+香蕉汁100 g/L培養(yǎng)基更適合紅心杉組培增殖。

適宜濃度的激素既有利于愈傷組織不定芽的形成，又會(huì)促進(jìn)不定芽的生長(zhǎng)發(fā)育［26］。因此，組培苗繼代增殖過(guò)程中，掌握激素的使用種類及濃度具有重要意義。韋如萍等［27］研究發(fā)現(xiàn)，MS+NAA 0.05 mg/L適宜杉木的增殖培養(yǎng)；黃碧華［28］對(duì)杉木組培苗研究時(shí)得出1/2MS+6-BA 0.8 mg/L最適宜杉木的增殖培養(yǎng)。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的TDZ對(duì)紅心杉組培苗增殖具有促進(jìn)作用。黃卓輝等［29］認(rèn)為TDZ能有效影響與細(xì)胞分化有關(guān)的各種酶的活性，從而影響植株生長(zhǎng)?？荡罅Φ龋?0］研究結(jié)果表明，TDZ在喜樹(shù)愈傷組織培養(yǎng)中可替代植物激素并對(duì)細(xì)胞植物色素積累有明顯影響。崔瑾等［31］認(rèn)為，TDZ能有效誘導(dǎo)芋莖尖的萌動(dòng)、生長(zhǎng)，促進(jìn)大量叢生芽增殖和組培苗根系發(fā)生，提高馴化成活率，這也證實(shí)了本研究中TDZ對(duì)葉綠素含量和增殖的影響。在組織培養(yǎng)中還經(jīng)常使用到椰汁、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、馬鈴著汁等天然有機(jī)添加物［32］，這些有機(jī)添加物汁液中含有氨基酸、激素、酶和一些化學(xué)成分不明的有機(jī)物，其營(yíng)養(yǎng)豐富但不穩(wěn)定，是復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)混合物，主要作用是為植物生長(zhǎng)提供一些生理活性物質(zhì)，補(bǔ)充一些未知的微量成分［33］。有研究表明，一定濃度的香蕉泥有利于鐵皮石斛組培原球莖的分化，提高分化率［34］，有效提高鐵皮石斛莖段和組培苗叢生芽的増殖系數(shù)［35］；添加香蕉汁適宜帶葉兜蘭叢生芽的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)［36］。在本研究中，雖然香蕉汁對(duì)紅心杉組培苗各項(xiàng)指標(biāo)的影響不是最主要的，但是隨著香蕉汁濃度的增加，紅心杉組培苗的葉綠素、可溶性糖含量都有所提高，這可能與香蕉汁富含有機(jī)成分，對(duì)植株鮮重、株高和莖粗等的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用有關(guān)［37］，而葉綠素含量高有益于組培苗的增殖和生長(zhǎng)［38-39］。郎賢波［40］研究豐滿紅樹(shù)莓組培快繁時(shí)指出，可溶性糖含量對(duì)組培苗增殖具有促進(jìn)作用。由于香蕉汁中含有激素等成分，所以在與TDZ配合使用時(shí)應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化紅心杉及其他杉木品種組培不同階段的使用濃度，并探討其對(duì)組培苗后期生長(zhǎng)質(zhì)量的影響。

組培是一個(gè)復(fù)雜繁瑣的過(guò)程，培養(yǎng)基成分是影響組培成功與否的關(guān)鍵因素，而外源添加物種類和濃度的選擇將會(huì)大大提高植物組培在誘導(dǎo)、增殖、生根等過(guò)程的成功率。紅心杉的組培技術(shù)已取得一些進(jìn)展，但多數(shù)研究集中于培養(yǎng)基選擇、激素濃度等方面，在天然復(fù)合物應(yīng)用研究方面還較少，而復(fù)合物在經(jīng)濟(jì)性上占很大優(yōu)勢(shì)，今后可在復(fù)合物種類、濃度方面進(jìn)一步優(yōu)化，以提高增殖率及芽苗質(zhì)量，并在后續(xù)工作中探討提高組培苗生根率的方法，達(dá)到紅心杉組培快繁的目的。

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