吳文杰，劉良紅，黃鶯（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410208；2.香港浸會(huì)大學(xué)化學(xué)院，香港；.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南懷化 418000）

葛根和粉葛分別為豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]和甘葛藤（P.thomsoniiBenth.）的干燥根，在中醫(yī)用藥史上二者均作為葛根（P.radix）藥材使用，具有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽(yáng)止瀉的作用[1]。葛根和粉葛被收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[2]；國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布的國(guó)衛(wèi)辦食品函〔2014〕975號(hào)文件中，在原有的85種藥食同源產(chǎn)品名單（含葛根）的基礎(chǔ)上新增了15種藥食同源產(chǎn)品（含粉葛）[3]，這說(shuō)明二者需區(qū)別對(duì)待，以保證葛根藥材安全、合理使用。已有藥理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，葛根藥材中的有效成分具有改善心肌代謝及血管微循環(huán)、擴(kuò)張冠狀血管、緩解高血壓、預(yù)防心律失常、改善腦血管循環(huán)、發(fā)揮雌激素樣效果、保護(hù)肝腎、抗自由基、抗缺氧癥狀、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、解酒等作用[4]。而異黃酮類成分是發(fā)揮藥理活性的主要藥效物質(zhì)[5]，因此可作為葛根藥材質(zhì)量分析的指標(biāo)性成分。

目前，葛根藥材質(zhì)量分析的方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[6-7]，但是考慮到葛根藥材中含有多種化學(xué)成分，基質(zhì)干擾較大，會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性；同時(shí)其含有的一些異黃酮類成分含量較低，以HPLC法測(cè)定會(huì)由于靈敏度不夠而不易被檢出。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）具有穩(wěn)定性良好、不受雜質(zhì)干擾、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)[8]。中藥定量分析中常用的串聯(lián)質(zhì)譜是三重四級(jí)桿質(zhì)譜（QqQ），其在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下可得到準(zhǔn)分子離子質(zhì)量和二級(jí)碎片質(zhì)荷比的信息，加之該方法操作方便，故常被用于中藥有效成分檢測(cè)和質(zhì)量控制[9-10]。但仍鮮見(jiàn)在MRM模式下測(cè)定葛根藥材中異黃酮類成分的報(bào)道，也尚未見(jiàn)MRM模式結(jié)合主成分分析和聚類分析區(qū)分葛根藥材的報(bào)道。

基于此，本試驗(yàn)采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定了葛根藥材中14種異黃酮類成分的含量，用于藥材的整體質(zhì)量控制；同時(shí)，采用主成分分析和聚類分析法區(qū)分14批不同來(lái)源（產(chǎn)地或種類）的葛根藥材，旨在為評(píng)價(jià)葛根藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AB SCIEX 5500型質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；1260型HPLC儀，包括柱溫箱、二元溶劑管理器、自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；AUW2200型十萬(wàn)分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；KQ3200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：150 W，頻率：40 kHz）。

1.2 試劑

葛根素對(duì)照品（批號(hào)：3681-99-0）、葛根素-6″-O-木糖苷對(duì)照品（批號(hào)：114240-18-5）、葛根素芹菜糖苷對(duì)照品（批號(hào)：103654-50-8）、4′-O-甲基葛根素對(duì)照品（批號(hào)：92117-94-7）、大豆苷元對(duì)照品（批號(hào)：486-66-8）、大豆苷對(duì)照品（批號(hào)：552-66-9）、芒柄花黃素對(duì)照品（批號(hào)：485-72-3）、刺芒柄花苷對(duì)照品（批號(hào)：486-62-4）、染料木苷對(duì)照品（批號(hào)：529-59-9）、染料木素對(duì)照品（批號(hào)：446-72-0）、黃豆黃苷對(duì)照品（批號(hào)：40246-10-4）、黃豆黃素對(duì)照品（批號(hào)：40957-83-3）、鳶尾苷對(duì)照品（批號(hào)：611-40-5）、鳶尾黃素對(duì)照品（批號(hào)：548-77-6）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司（純度經(jīng)HPLC法檢測(cè)均不低于98%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

葛根藥材分別來(lái)自于我國(guó)不同地區(qū)，經(jīng)昆明植物標(biāo)本館劉恩德博士鑒定為豆科葛屬植物野葛[P.lobata（Willd.）Ohwi]或甘葛藤（粉葛）（P.thomsoniiBenth.）的根。葛根藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，20%A～70%A；30～40 min，70%A）；流速：0.8 mL/min；柱溫：22 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

表1 葛根藥材來(lái)源Tab 1 Sources of P.radix

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；檢測(cè)方式：負(fù)離子檢測(cè)；掃描模式：MRM；噴射電壓：-4 500 V；離子源溫度：600 ℃；霧化氣：60 psi；輔助氣：60 psi；碰撞氣：7 psi；氣簾氣：30 psi。14種待測(cè)異黃酮類化學(xué)成分的液質(zhì)法參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 14種待測(cè)異黃酮類成分的液質(zhì)法參數(shù)Tab 2 LC-MS parameters of 14 kinds of isoflavones

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液 分別取葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、4′-O-甲基葛根素、大豆苷元、大豆苷、芒柄花黃素、刺芒柄花苷、染料木苷、染料木素、黃豆黃苷、黃豆黃素、鳶尾花苷、鳶尾黃素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品貯備液。分別量取上述單一對(duì)照品貯備液適量，逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別均為10、20、50、100、200、500、800、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取藥材樣品粉碎，過(guò)40目篩，于40℃干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定。烘干后取0.1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，室溫條件下放冷，用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)后，取續(xù)濾液并稀釋至一定質(zhì)量濃度（在線性范圍內(nèi)），即得。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μL，分別按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，各待測(cè)成分在樣品中的提取離子流圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，各待測(cè)成分均未檢測(cè)到干擾成分，表明方法專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

吸取“2.3.1“項(xiàng)下各質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液各5 μL，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程與線性范圍見(jiàn)表3（注：考慮到葛根素含量最高，故采用的質(zhì)量濃度上限為5 000 ng/mL進(jìn)行回歸分析，其余13種成分則采用1 000 ng/mL進(jìn)行回歸分析）。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（100 ng/mL）5 μL，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，14種待測(cè)成分峰面積的RSD均小于3.47%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取藥材樣品（編號(hào)：PL-5）粉末0.1 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置12、24、36、48、60、72 h時(shí)按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，14種待測(cè)成分峰面積的RSD均小于5.00%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置72 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取藥材樣品（編號(hào)：PL-5）粉末0.1 g，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，14種待測(cè)成分含量的RSD均小于3.93%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱取藥材樣品（編號(hào)：PL-5）粉末0.1 g，共6份，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，14種待測(cè)成分的平均加樣回收率為95%～105%，RSD為0.80%～4.50%（n＝6）。

2.10 含量測(cè)定

分別取各批藥材樣品適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.11 主成分分析與聚類分析

采用SIMCA 13.0軟件對(duì)14批不同來(lái)源的葛根藥材進(jìn)行主成分投影分析，把14個(gè)成分轉(zhuǎn)化為第一主成分和第二主成分兩個(gè)綜合性指標(biāo)，詳見(jiàn)圖2。由圖2可知，兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為71.4%和15.9%。采用SIMCA 13.0軟件對(duì)14批不同來(lái)源的葛根藥材進(jìn)行聚類分析，詳見(jiàn)圖3。由圖3可知，14批葛根藥材可聚為4類：PL-2為Ⅰ類；PL-3、PL-4為Ⅱ類；PL-5～PL-7為Ⅲ類；PL-1、PT-1～PT-7為Ⅳ類。

圖1 各待測(cè)成分的提取離子流圖Fig 1 Extraction ion chromatograms of components to be measured

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本試驗(yàn)分別考察了乙腈和甲醇作為流動(dòng)相中的有機(jī)相，發(fā)現(xiàn)乙腈和甲醇作為有機(jī)相時(shí)具有相似的色譜分離效果及質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度，但是因乙腈比甲醇昂貴且毒性更大，故選擇甲醇作為流動(dòng)相中的有機(jī)相。筆者又以甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，比較了不同比例甲酸（0.1‰、0.5‰、1‰）和乙酸（0.1‰、0.2‰、0.5‰）對(duì)分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述酸溶液對(duì)各待測(cè)異黃酮類成分的峰形、響應(yīng)強(qiáng)度和分離效果并無(wú)明顯影響。為使操作方法簡(jiǎn)便易行，故選擇甲醇-水作為流動(dòng)相。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于異黃酮類成分中含有1個(gè)或多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)容易失去氫，因此選用負(fù)離子模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分子離子峰（監(jiān)測(cè)母離子）均為[M-H]-。筆者又通過(guò)改變碰撞能量選擇具有較高響應(yīng)的碎片離子作為監(jiān)測(cè)子離子，并使母離子和監(jiān)測(cè)子離子的響應(yīng)比接近1∶3，以使MRM模式效果較好。

3.3 異黃酮總含量分析

表3 回歸方程與線性范圍Tab 3 Regression equations and linear ranges

表4 藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（mg/g）

圖2 主成分投影圖Fig 2 Principal component projection drawing

圖3 聚類分析樹狀圖Fig 3 Hierarchical cluster analysis diagram

由表4可知，葛根藥材中14種待測(cè)異黃酮類成分的總含量范圍為37.337～74.911 mg/g（PL-1～PL-7）、5.127～19.036 mg/g（PT-1～PT-7），表明野葛和粉葛中異黃酮類成分總含量存在明顯差異。在14批藥材中，產(chǎn)地為云南芒市（PL-2）和甘肅天水（PL-4）的野葛比其他產(chǎn)地野葛的異黃酮類總含量明顯更高，產(chǎn)地為云南峨山（PT-1）和云南大關(guān)（PT-2）的粉葛比其他產(chǎn)地粉葛的異黃酮類總含量明顯更高，這說(shuō)明不同產(chǎn)地的葛根藥材質(zhì)量可能存在明顯差異。同時(shí)，葛根素在14種異黃酮類成分中含量最高，在云南芒市（PL-2）和甘肅天水（PL-4）產(chǎn)野葛中其含量分別為43.735、40.998 mg/g，比其他產(chǎn)地野葛中的葛根素含量明顯更高；在云南峨山（PT-1）和云南大關(guān)（PT-2）產(chǎn)粉葛中其含量分別為9.816、12.079 mg/g，比其他產(chǎn)地粉葛中的葛根素含量明顯更高，提示葛根素可以作為反映葛根藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。

綜上所述，本研究所建立的LC-MS/MS法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性良好，可用于檢測(cè)葛根藥材中14種異黃酮類成分的含量，適用于該藥材的整體質(zhì)量控制。

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