羅喜鋼，王毅，張鳳香

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 檢驗(yàn)中心，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胸外科，遼寧 錦州 121001）

血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1,HO-1）活性對熱較穩(wěn)定，又被稱為熱休克應(yīng)激反應(yīng)蛋白32，是HO亞型中的可誘導(dǎo)型。在正常的情況下，機(jī)體內(nèi)各種組織器官中的HO-1表達(dá)水平極低，當(dāng)機(jī)體受到一些刺激因素時(shí)其表達(dá)水平和生物活性會有所提高。其中能夠刺激HO-1產(chǎn)生的活化信號分子包括血紅素、內(nèi)毒素、活性氧和生長因子等。在上述誘因下可誘導(dǎo)HO-1生成[1]，而鋅原卟啉等物質(zhì)對其有抑制作用。血紅素在其限速酶HO-1的催化下可以代謝生成CO、鐵離子和膽綠素，膽綠素經(jīng)過還原酶的作用生成膽紅素[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[3]，HO-1與其代謝產(chǎn)物有一定的抗炎、抗凋亡、舒張血管等作用。HO-1在許多疾病中都起重要的保護(hù)作用，抑制腎臟HO-1活性會導(dǎo)致腎臟血流灌注減少加重腎功能不全，提高HO-1活性恰恰與其相反。

本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制2型糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）大鼠模型，使用HO-1誘導(dǎo)劑氯化血紅素和抑制劑鋅原卟啉對大鼠模型進(jìn)行藥物干預(yù)后，分析不同組別大鼠腎臟損傷程度與腎臟中HO-1表達(dá)之間的關(guān)系，探討HO-1對2型糖尿病腎病腎臟損傷是否具有保護(hù)作用，為2型糖尿病導(dǎo)致的腎臟損傷提供新的治療思維方式。

1 材料與方法

1.1 一般資料

200～250 g健康清潔6周齡雄性SD大鼠32只，遼寧長生生物技術(shù)有限公司供給，合格證：SCXK（遼）2010-0001，分籠飼養(yǎng)。氯化血紅素、鋅原卟啉（美國Sigma公司），HO-1多克隆抗體、免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）復(fù)制DN模型，72 h后用快速血糖儀測血糖，其中≥16.65 mmol/L的大鼠入選實(shí)驗(yàn)組。確定模型復(fù)制成功后，各組大鼠分別進(jìn)行藥物干預(yù)。氯化血紅素是HO-1的誘導(dǎo)劑，DN氯化血紅素組大鼠腹腔注射氯化血紅素30 μmol/kg，1次/2 d，連續(xù)4周；鋅原卟啉是HO-1抑制劑，DN鋅原卟啉組大鼠腹腔注射鋅原卟啉10 μmol/kg，1次/2 d，連續(xù)4周；正常對照組和DN組大鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水。氯化血紅素與鋅原卟啉溶液均需現(xiàn)用現(xiàn)配以免藥物失效，藥物需要避光配制。使用0.2 mol/L的氫氧化鈉NaOH溶液對藥品進(jìn)行充分的溶解后，0.2 mol/L的氯化氫HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4～8.0。

大鼠腹腔用藥4周后，分別收集各組大鼠24 h尿液。根據(jù)大鼠的體重腹腔注射一定量的10%水合氯醛充分麻醉大鼠，待大鼠麻醉后固定大鼠的四肢于手術(shù)臺上，取血3 ml，將血液緩慢推入一次性試管中，靜止一段時(shí)間，當(dāng)有血塊凝集后，以3 000 r/min離心10 min后輕輕取出試管，使用移液器將上層血清轉(zhuǎn)移至無菌EP管中。使用全自動(dòng)生化分析儀檢測各組大鼠血中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）、血肌酐（serum creatinine,Scr）、尿肌酐（urine creatinine,Ucr）和胱抑素C（cystatin-c,Cys-c）濃度，計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率（creatinine clearance,Ccr），做相關(guān)性分析。

取血后開腹取大鼠的肝臟和腎臟組織，雙側(cè)腎臟使用大量生理鹽水反復(fù)洗至顏色蒼白為止，取大鼠左側(cè)部分腎臟組織將其修飾為5 mm×5 mm×5 mm左右的組織塊，迅速置于10%甲醛中固定，用于HE染色、免疫組織化學(xué)分析，同時(shí)取1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，2%戊二醛和1%鋨酸固定，用于電鏡觀察。取右側(cè)腎臟立即放置到-80℃冰箱中用于Western blot檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

經(jīng)單因素方差分析，4組大鼠Scr、Cys-c、Ucr、Ccr比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，DN組、DN氯化血紅素組和DN鋅原卟啉組Scr、Ucr、Cys-c、Ccr、Cys-c比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DN 組 Scr、Cys-c升高（t=7.021 和 27.502，P=0.004和 0.001），Ucr、Ccr降低（t=-6.143和-5.604，P=0.007和0.008）。與DN組比較，DN氯化血紅素組的Scr、Cys-c降低（t=5.041和11.893，P=0.007和0.003），Ucr、Ccr增高（t=-3.922和 -3.623，P=0.009和0.015）。與DN組比較，DN鋅原卟啉組Scr、Cys-c增高（t=-13.924和-6.391，P=0.003和 0.009），Ucr、Ccr降低（t=2.481和7.183，P=0.021和0.006）。見附表。

2.2 腎臟組織形態(tài)學(xué)改變

光鏡下可觀察到對照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球基底膜厚度均勻，足突細(xì)胞排列有序；DN組大鼠腎小球與腎小管結(jié)均有改變，腎小管上皮細(xì)胞排列不整齊，并且有腫脹，脫落等現(xiàn)象，在腎小管中還可見有管型生成，腎小球基底膜增厚，腎小球有一定程度上的萎縮；DN氯化血紅素組大鼠腎小管上皮細(xì)胞濁腫，空泡樣的變性，刷狀緣丟失；DN鋅原卟啉組大鼠腎小管和腎小球的病變最為嚴(yán)重，可見腎小管管腔擴(kuò)大，上皮細(xì)胞水腫變性，大量的脫落，細(xì)胞質(zhì)和線粒體中有空泡形成，腎小球萎縮，鮑曼囊腔擴(kuò)大，腎小球基底膜不均勻的增厚，足突細(xì)胞大量的融合。見圖1～3。

2.3 腎臟中HO-1表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腎臟中有一定量的HO-1表達(dá)；DN組大鼠腎臟中HO-1的表達(dá)較正常對照組大鼠降低；DN氯化血紅素組大鼠腎臟中HO-1表達(dá)高于其他各組；DN鋅原卟啉組大鼠腎臟中幾乎沒有HO-1的表達(dá)。見圖4。

附表 各組大鼠 Scr、Ucr、Ccr、Cys-c 比較 （n =8，±s）

附表 各組大鼠 Scr、Ucr、Ccr、Cys-c 比較 （n =8，±s）

注：1）與正常對照組比較，P ＜0.05；2）與DN組比較，P ＜0.05；3）與DN氯化血紅素組比較，P ＜0.05

組別 Scr/（μmol/L） Ucr/（mmol/L） Ccr/（ml/min） Cys-c/（mg/L）正常對照組 35.59±1.35 9.72±1.12 4.21±0.79 0.24±0.03 DN組 70.52±5.211） 6.42±0.931） 2.40±0.371） 0.75±0.041）DN氯化血紅素組 50.96±2.131）2） 8.55±1.031）2） 3.40±0.621）2） 0.50±0.031）2）DN 鋅原卟啉組 110.18±8.251）2）3） 5.02±1.121）2）3） 1.03±0.301）2）3） 0.91±0.051）2）3）F值 251.315 27.325 38.781 436.206 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 腎臟組織形態(tài) （HE染色×200）

圖2 腎小管組織形態(tài) （電鏡×10 000）

圖3 腎小球組織形態(tài) （電鏡×5 000）

圖4 腎臟HO-1蛋白表達(dá)

3 討論

HO-1是血紅素代謝過程中的關(guān)鍵酶[4]，也是器官、組織、細(xì)胞受損后機(jī)體內(nèi)重要的保護(hù)性酶。HO-1具有抗炎、抗凋亡、抗氧化和維持應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞穩(wěn)定性的作用[5]。此外，現(xiàn)已公認(rèn)HO-1在血液循環(huán)系統(tǒng)具有重要的作用，是潛在的血管調(diào)節(jié)器[6]。本實(shí)驗(yàn)通過藥物干預(yù)改變DN大鼠腎臟內(nèi)HO-1的表達(dá)水平，DN氯化血紅素組大鼠通過腹腔注射氯化血紅素來增加腎臟中HO-1的生成，DN鋅原卟啉組大鼠通過腹腔注射鋅原卟啉減少腎臟HO-1生成。免疫組織化學(xué)和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常對照組大鼠腎臟中有少量HO-1表達(dá)；DN組大鼠腎臟中的HO-1表達(dá)較正常對照組降低；DN氯化血紅素組大鼠腎臟中有大量的HO-1表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞；DN鋅原卟啉組大鼠腎臟內(nèi)幾乎沒有HO-1的表達(dá)。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提高DN大鼠腎臟中HO-1的表達(dá)，可以提高腎臟濾過功能并減輕腎臟組織形態(tài)的損傷程度，在一定程度上改善了腎功能。相反，減少DN大鼠腎臟中的HO-1的表達(dá)水平，腎臟內(nèi)Ccr下降，腎小管和腎小球都有一定程度上的損傷，并且小管的損傷程度較腎小球嚴(yán)重，但是確切的作用機(jī)制仍不完全清楚，需要進(jìn)一步去探究驗(yàn)證。

[1]ZHU K,GUO X,PENG W,et al.Protective effects of wheat germ protein isolate hydrolysates (WGPIH) against hydrogen peroxideinduced oxidative stress in PC12 cells[J].Food Res,2013,53(5):297-303.

[2]WONG P,MURRAY C,LOUW J,et al.Adult bronchopulm- onary dysplasia: computed tomography pulmonary findings[J].J Med Imaging Radiat Oncol,2011,55(7): 373-378.

[3]STEFANSON A,BAKOVIC M.Dietary regulation of Keap1/Nrf2/ARE pathway: focus on plant-derived compounds and trace minerals[J].Nutrients,2014,6(8): 3777-3801.

[4]IHO S,MAEYAMA J,SUZUKI F.CpG oligodeoxynucleotides as mucosal adjuvants[J].Hum Vaccin Immunother,2015,11(4): 755-760.

[5]SCHEIERMANN J,KLINMAN D M.Clinical evaluation of CpG oligonucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases and cancer[J].Vaccine,2013,32(5): 6377-6389.

[6]GAO H,MENG J,XING H,et a1.Association of heme oxygenase-1 with the risk of polycystie ovary syndrome in nonobese women[J].Hum Reprod,2014,29(5): 1058-1066．