任曉曉，張小茜，張紅梅，馮玉光，董秀紅，史立宏，邵翠

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院研究生院，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，山東 濰坊 261031；3.濰坊醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053）

胃癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位居前列[1]，臨床診斷時多已進入晚期，發(fā)生多臟器轉(zhuǎn)移，為延緩患者生存時間，大多以放化療替代手術(shù)治療。塞來昔布是新型環(huán)氧合酶2（cyclooxyegenase-2, COX-2）選擇性抑制劑，是非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）一種，可抑制腫瘤的生長及新生血管生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥（multi-drug resistance,MDR），并加強化療藥的放射敏感性和細(xì)胞毒性作用，與化、放療產(chǎn)生協(xié)同作用，進而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-4]。筆者之前的動物實驗發(fā)現(xiàn)，在裸鼠體內(nèi)塞來昔布能聯(lián)合氟尿嘧啶（5-Fu）協(xié)同抗腫瘤，并可降低腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物低氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α）、ATP 結(jié)合盒基因 2（ATP-binding cassette gene 2, ABCG2）、八聚體轉(zhuǎn)錄因子4（Octamerbinding Transcription Factor 4, OCT-4）的表達(dá)，從而改善和逆轉(zhuǎn)5-Fu的化療抵抗[5]。本研究的目的是探討塞來昔布與FOLFOX4方案聯(lián)合在治療晚期胃癌中的療效，進一步研究ABCG2、OCT-4、HIF-2α與胃癌化療抵抗、多藥耐藥的關(guān)系，為晚期胃癌的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月-2017年5月于濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科就診經(jīng)病理和電子胃鏡證實的80例晚期胃癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①晚期胃癌患者TNM分期為ⅢB期、ⅢC期或Ⅳ期；②因年齡大、心肺功能差或其他原因不能手術(shù)或拒絕手術(shù)的晚期胃癌患者。隨機分成實驗組和對照組各40例。其中，男性49例，女性31例；年齡48～90歲，平均64.3歲。

1.2 實驗試劑

兔抗人HIF-2α多克隆抗體、鼠抗人ABCG2單克隆抗體及OCT-4單克隆抗體（購于Abcam公司），PV-9000試劑盒、DAB試劑（購于北京中杉金橋有限公司），DNA Marker（購于Thermo公司），二抗（抗兔）（購于Proteintech公司），二抗（抗鼠）（購于Biosharp公司），β-actin（購于Santa公司），RIPA裂解液（購于Solarbio公司），Trizon、HiFi Script Gdna Removal cDNA Synthesis Kit、DNA marker、Taq Master Mix（購于康為世紀(jì)生物科技有限公司），上海生工生物工程股份有限公司合成PCR所需引物。

1.3 化療方案

在征得患者家屬知情同意的基礎(chǔ)上，實驗組應(yīng)用塞來昔布聯(lián)合FOLFOX4化療方案：奧沙利鉑（OXA）85 mg/m2，靜脈滴注2 h，第1天；塞來昔布0.2 g，1次/d，口服，第1～5天；亞葉酸鈣（CF）200 mg/m2，靜脈滴注2 h，第1～2天；5-氟尿嘧啶（5-Fu）400 mg/m2，快速靜脈滴注 0.5 h，5-Fu 600 mg/m2，持續(xù)靜脈滴注22 h，第1～2天。對照組用FOLFOX4方案，化療劑量及時間同治療組。每3周重復(fù)，21 d為1個周期，共用4個周期。

1.4 療效評價

每2個周期評價療效1次，若出現(xiàn)可能為病情進展的臨床表現(xiàn)可提前評價療效。所有患者進行隨訪。療程結(jié)束4周后再行電子胃鏡和上腹CT檢查。參考WHO實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)[6]：完全緩解（complete remission, CR）：病灶完全消失，維持4周以上。部分緩解（partial remission, PR）：病灶減少50%以上并維持4周以上。穩(wěn)定（stable disease, SD）：病灶縮小＜25%，或增大＜25%，無新病灶出現(xiàn)。進展（progressive disease, PD）：腫瘤增大超過25%，或出現(xiàn)新病灶。按照治療效果分為有效（包括CR和PR）與無效（包括SD和PD），疾病有效率（RR）=（CR+PR）/總例數(shù)×100%。分別檢測實驗組和對照組治療后ABCG2、OCT-4、HIF-2α的mRNA和蛋白表達(dá)。

1.5 ABCG2、OCT-4及HIF-2αmRNA表達(dá)的檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測mRNA的表達(dá)。用Trizol法提取胃癌中的RNA，以35 μl DEPC水溶解，測得各組中mRNA的濃度和純度，并將各組稀釋成相同濃度。引物序列如下：GAPDH正向5'-GCACCACCAACTGCTTAGCAC-3'，反向：5'-GCAGC GCCAGTAGAGGCAGG-3'，產(chǎn)物片段 143 bp；OCT-4正向：5'-CCCGAAAGAGAAAGCGAACC-3'，反向：5'-CA GAACCACACTCGGACCAC-3'，產(chǎn)物片段151 bp；ABCG2 正 向 ：5'-CCCTTATGATGGTGGCTTATTC-3'，反向：5'-GTGAGATTGACCAACAGACCAT-3'，產(chǎn)物片段132 bp；HIF-2α 正向：5'-CTTGGAGGGTTTCATTGCTG TGGT-3'，反向：5'-GTGAAGTCAAAGATGCTGTGTCCT-3'，產(chǎn)物片段123 bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃ 2 min終延伸。2%瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用Image J圖像分析軟件計算條帶灰度值，以ABCG2、OCT-4及HIF-2α mRNA灰度值與GAPDH灰度值的比值表示mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 胃癌組織中ABCG2、OCT-4及HIF-2α蛋白表達(dá)的檢測

采用免疫組織化學(xué)（簡稱免疫組化）法。將收集到的部分胃癌組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，包埋切片，脫蠟入水，按照PV-9000試劑盒說明書進行操作。陰性對照用PBS代替一抗。結(jié)果判定：ABCG2和OCT-4陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，HIF-2α陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，部分胞核也有少量表達(dá)。

1.7 Western blot檢測胃癌組織中HIF-2α、ABCG2及OCT-4蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解液提取組織中的蛋白，BCA法測定蛋白濃度，并將其調(diào)節(jié)成統(tǒng)一濃度。取6 μl蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育（4℃過夜），37℃孵育1 h，TBST洗滌，X射線曝光、顯影、定影后觀察結(jié)果。應(yīng)用Image J圖像分析軟件，分析HIF-2α、ABCG2、OCT-4的表達(dá)，以HIF-2α、ABCG2、OCT-4灰度值與β-actin灰度值的比值表示蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療效果

實驗組中有效率為77.5%（31/40），對照組有效率為42.5%（17/40），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.208，P=0.001）。

2.2 ABCG2、OCT-4及HIF-2α mRNA的表達(dá)

兩組間ABCG2、OCT-4及HIF-2α mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（HIF-2α：t=21.517，P=0.000；ABCG2：t=27.348，P=0.000；OCT-4：t=62.470，P=0.000）。實驗組低于對照組。見圖1和表1。

2.3 ABCG2、OCT-4、HIF-2α蛋白的表達(dá)

實驗組ABCG2、OCT-4及HIF-2α蛋白的較對照組降低，ABCG2和OCT-4胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，HIF-2α胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，部分胞核也有少量表達(dá)。見圖2～4。

2.4 胃癌組織中HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白的表達(dá)

圖1 HIF-2α、ABCG2及OCT-4 mRNA在胃癌組織中的表達(dá) （RT-PCR）

表1 兩組HIF-2α、ABCG2及OCT-4 mRNA相對表達(dá)量 （±s）

表1 兩組HIF-2α、ABCG2及OCT-4 mRNA相對表達(dá)量 （±s）

組別 HIF-2α ABCG2 OCT-4實驗組 0.471±0.025 0.500±0.018 0.456±0.007對照組 0.752±0.007 0.793±0.011 0.873±0.011 t值 21.517 27.348 62.470 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 ABCG2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

兩組間HIF-2α、ABCG2及OCT-4蛋白的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（HIF-2α：t=41.306，P=0.000；ABCG2：t=56.607，P=0.000；OCT-4：t=31.048，P=0.000）。實驗組低于對照組。見圖5和表2。

圖3 OCT-4蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

圖4 HIF-2α蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

圖5 胃癌組織中HIF-2α、ABCG2及OCT-4 蛋白的表達(dá) （Western blot）

表2 兩組HIF-2α、ABCG2及OCT-4蛋白相對表達(dá)量（±s）

表2 兩組HIF-2α、ABCG2及OCT-4蛋白相對表達(dá)量（±s）

組別 HIF-2α ABCG2 OCT-4實驗組 0.273±0.014 0.320±0.013 0.388±0.006對照組 0.678±0.009 0.818±0.008 0.538±0.006 t值 41.306 56.607 31.048 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

FOLFOX方案治療晚期胃癌的總體有效率不超過50%，中位生存期僅8.0～11.9個月[7-8]，轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高達(dá)80%以上。許多研究表明，低氧微環(huán)境和腫瘤干細(xì)胞的存在是影響腫瘤放化療敏感性及發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的重要原因[9-10]。因此研究胃癌患者的化療是目前消化道腫瘤領(lǐng)域研究的一大重點。有研究證明，塞來昔布能抑制COX-2通路的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，改善腫瘤微環(huán)境，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-13]。塞來昔布與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗腫瘤作用，可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖促進細(xì)胞凋亡[14]。本研究顯示，治療晚期胃癌時實驗組有效率高于對照組。塞來昔布聯(lián)合FOLFOX4化療影響胃癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，提高患者的化療敏感性，其療效優(yōu)于單獨的FOLFOX4化療方案。

慢性缺氧通常又是實體瘤廣泛生長的原因[15]。微環(huán)境變化與缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factors，HIF）有關(guān)[16]。HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α 是 HIF的3個亞型，其中HIF-2α與CSCs的關(guān)系最密切，研究表明，HIF-2α通過減少OCT-4、Notch等多種干細(xì)胞通路的表達(dá)適應(yīng)微環(huán)境的變化[17]。ABCG2是一種在腫瘤組織中高表達(dá)與化療耐藥相關(guān)的膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員。OCT-4是一種與腫瘤耐藥相關(guān)的POU轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)水平直接影響干細(xì)胞的分化方向[18-19]。多種CSCs高表達(dá)ABCG2、OCT-4和HIF-2α，CSCs的化療耐藥與HIF-2α-ABCG2和HIF-2α-OCT-4通路高表達(dá)有關(guān)[20-21]。此外研究顯示，HIF-2α可調(diào)節(jié)ABCG-2、OCT-4的產(chǎn)生，缺氧HIF-2α/ABCG2/MDR途徑可促進乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥[5，22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在治療晚期胃癌時，實驗組中ABCG-2、OCT-4、HIF-2α的mRNA及蛋白表達(dá)較對照組降低，其機制可能通過降低HIF-2α-ABCG2和HIF-2α-OCT-4通路的表達(dá)，改善FOLFOX4化療方案的化療抵抗、多藥耐藥。本研究還發(fā)現(xiàn)，塞來昔布聯(lián)合FOLFOX4化療方案有協(xié)同抗腫瘤作用，能協(xié)同抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，提高治療效果。本研究為晚期胃癌的聯(lián)合靶向治療提供新的思路和方法，具有良好的臨床應(yīng)用前景，但仍需要進一步探索。

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