周海萍 沈忠磊

胰腺癌是臨床上高發(fā)的惡性消化道腫瘤之一。近年來(lái)隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，胰腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著人們的健康[1-3]。有學(xué)者對(duì)胰腺癌分子發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在正常情況下，Hedgehog（HH）信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育、器官形成和干細(xì)胞維持的重要基礎(chǔ)，但其非正常激活可能與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因-1（Gli1）被認(rèn)為是HH信號(hào)通路活化的指標(biāo)，且在多種腫瘤組織中表達(dá)升高[4-6]。胰腺癌具有嗜神經(jīng)的特點(diǎn)，Sema4D是一種免疫信號(hào)素，參與神經(jīng)的生長(zhǎng)發(fā)育過程，同時(shí)在免疫和血液系統(tǒng)中發(fā)揮作用；從蛋白B1（Plexin-B1）作為其受體，兩者結(jié)合可參與細(xì)胞侵襲、生長(zhǎng)以及遷徙，與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系[7-9]。因此，本文就胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集本院2013年1月至2016年5月經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)證實(shí)的胰腺癌組織標(biāo)本69份，69例胰腺癌患者中男 36 例，女 33 例；年齡 41～77（58.3±12.6）歲；臨床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期29例，Ⅲ期29例；組織分化程度：高分化19例，中分化24例，低分化26例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。為進(jìn)行對(duì)照研究，又在2016年5至12月手術(shù)切除的34例胰腺癌組織標(biāo)本中切取了距胰腺癌組織3cm以外的正常胰腺組織標(biāo)本34份。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者術(shù)前未接受放化療、免疫治療；（2）各項(xiàng)資料完整。排除合并其他部位腫瘤、既往有放化療史的患者。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 將標(biāo)本組織作厚4μm的連續(xù)切片，石蠟包埋，常規(guī)脫蠟至水，切片浸入50mmol/L乙二胺四乙酸溶液（pH 8.0）中。用微波抗原修復(fù)10min，冷卻至室溫，充分水洗，PBS浸洗。滴加正常山羊血清封閉液，室溫維持20min。去掉多余液體，加入Plexin-B1、Gli1多抗或單抗，維持4℃過夜，PBS浸洗。加入SP 9 000通用型生物素標(biāo)記二抗，37℃維持40min；用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色30s，再用蘇木素復(fù)染，最后用系列乙醇脫水及透明，用中性樹膠封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) Plexin-B1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，Gli1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，均呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)。（1）著色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色為色1分，棕黃色為2分，褐色為3分；（2）陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；以上2種得分相乘所得總分＜3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性；＜3分為“-”；3～5分為“+”，6～9 分為“++”，＞9 分為“+++”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種組織標(biāo)本中Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)比較胰腺癌組織Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為72.46%（50/69）、53.62%（37/69），均高于正常胰腺組織的 20.59%（7/34）、26.47%（9/34），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.80、6.79，均P＜0.05），見表1。

表1 兩種組織標(biāo)本中Gli1蛋白表達(dá)水平比較（例）

2.2 69例胰腺癌患者Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 不同臨床分期、腫瘤直徑、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；不同年齡、腫瘤部位、組織分化程度的患者胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 69例胰腺癌患者Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達(dá)的相關(guān)性 胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.885，P＜0.05），見表3。

表3 69份胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

胰腺癌初期癥狀往往不明顯，早期診斷較為困難。等到患者就診時(shí)，往往已發(fā)生了轉(zhuǎn)移或侵犯了重要血管，故而無(wú)法采用根治性手術(shù)進(jìn)行治療。在諸多治療方法中，手術(shù)切除是效果較好的方法。但因胰腺癌的神經(jīng)和淋巴轉(zhuǎn)移特性，易造成術(shù)后短期腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后較差。因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療是治愈胰腺癌的關(guān)鍵[10-11]。胰腺癌具有嗜神經(jīng)性，神經(jīng)浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致疼痛；此外，還會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。神經(jīng)周圍浸潤(rùn)（PNI）是胰腺癌的一種復(fù)發(fā)方式，主要指腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)進(jìn)入神經(jīng)周圍的間隙或穿破神經(jīng)外膜沿著神經(jīng)束膜浸潤(rùn)的一種現(xiàn)象。Sema4D是一種免疫信號(hào)素，屬于軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子中的跨膜分子的Semaphorin家族的一員，參與神經(jīng)的生長(zhǎng)發(fā)育過程，同時(shí)也在免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)中發(fā)揮著作用。Sema4D高親和作用受體為Plexin-B1，兩者的結(jié)合可磷酸化Met下游的某些信號(hào)分子，從而參與細(xì)胞侵襲、生長(zhǎng)以及遷徙，與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道Plexin-B1蛋白在胰腺癌組織中高表達(dá)[12-13]。HH信號(hào)通路正常激活，是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育、器官形成和干細(xì)胞維持的重要基礎(chǔ)，而非正常激活可能與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)?；蚨ㄎ挥谌祟?2號(hào)染色體的Gli1蛋白是HH信號(hào)通路的終末，也是其重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，Gli1蛋白表達(dá)升高會(huì)激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。通過調(diào)控HH信號(hào)通路目的基因的轉(zhuǎn)錄，以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)移等多種分子的基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，被認(rèn)為是HH信號(hào)通路活化的指標(biāo)[14-15]。

本研究比較胰腺癌組織與癌旁正常組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中兩種蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于癌旁正常組織；間接說(shuō)明胰腺癌的發(fā)生與Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)密切相關(guān)。為深入研究Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，本文探討了兩者與胰腺癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果表明胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)與臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明Plexin-B1、Gli1可能參與了胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的全過程。因此，臨床上可以應(yīng)用Plexin-B1、Gli1作為早期診斷胰腺癌的腫瘤標(biāo)識(shí)物，且有望成為治療胰腺癌的新分子靶點(diǎn)。由于胰腺癌早期癥狀不明顯，因此早期診斷較為困難，僅采用一種腫瘤標(biāo)識(shí)物的確診率往往較低，故本研究探討了胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)；這表明Plexin-B1、Gli1有望成為早期診斷胰腺癌的聯(lián)合腫瘤標(biāo)識(shí)物，以提高臨床確診率。

綜上所述，胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯升高，與患者的臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。Plexin-B1、Gli1有望成為早期診斷胰腺癌的腫瘤標(biāo)識(shí)物，且兩者聯(lián)合診斷可提高確診率。

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