朱寧 周強 韓睿 程浩

鮑溫樣丘疹?。╞owenoid papulosis，BP）是一種與高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染關(guān)系密切的疾病[1]，組織病理呈低度惡性原位鱗癌表現(xiàn)[2]。本病易復(fù)發(fā)，難以根治，被認為與機體免疫功能低下尤其是皮損局部抗病毒細胞免疫不足，不能建立對HPV有效的免疫應(yīng)答有關(guān)，但具體發(fā)病機制尚未完全闡明。朗格漢斯細胞（LC）是參與機體皮膚和黏膜組織抗病毒感染的重要免疫細胞，可通過捕獲與遞呈病毒抗原啟動對病毒的免疫應(yīng)答。然而BP患者中HPV感染常呈持續(xù)狀態(tài)，使得本病反復(fù)遷延不愈[3]，推測BP皮損局部可能存在LC某種功能受損。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）屬于CC型趨化因子，對趨化LC自骨髓遷移至皮膚及LC分化成熟、抗原遞呈等功能起重要作用，研究BP皮損局部MCP-1的表達有利于進一步了解LC功能受損的原因。目前關(guān)于BP皮損中LC及MCP-1的分布、形態(tài)及表達報道少見，LC在BP中的作用也尚未清楚?；诖?，本研究采用免疫組化技術(shù)檢測BP患者皮損及皮損旁正常皮膚組織中LC的標記分子CD1a及與其功能相關(guān)的MCP-1的表達，旨在探討LC和MCP-1在BP發(fā)病機制中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008年7月至2013年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院收治的36例BP患者的皮損蠟塊，均符合BP臨床診斷并經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。其中男 26 例，女 10 例；年齡 21～64（33.06±10.38）歲；病程 1～36（7.33±8.00）個月。男性皮損部位包括龜頭、冠狀溝、包皮、陰莖、陰囊；女性皮損部位包括會陰、肛周、陰道口、大小陰唇等?；颊呔懦陨砻庖咝约膊?、病毒性肝炎、結(jié)核及糖尿病等可能影響機體免疫力的疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院和學(xué)校醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 鼠抗人CD1a單克隆抗體、兔抗人MCP-1多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，即用型UltraSensitivTMS-P免疫組化試劑盒、二抗（生物素標記的羊抗鼠、羊抗兔）、DAB酶底物顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CD1a、MCP-1的免疫組化染色 分別取36例BP患者局部皮損和配對的皮損旁正常皮膚組織，標本經(jīng)10%中性緩沖甲醇溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4μm。采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶法（SP法），按照試劑盒說明書操作，常規(guī)脫蠟，水化，抗原修復(fù)，依次滴加過氧化物酶阻斷劑，封閉血清，分別用鼠抗人CD1a單克隆抗體、兔抗人MCP-1多克隆抗體進行免疫組化染色，以PBS代替一抗作為陰性對照，一抗工作液稀釋濃度為1∶100，生物素標記的二抗，鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染并封片，光鏡下觀察并判定結(jié)果。

1.3.2 免疫組化染色結(jié)果判定

1.3.2.1 CD1a+LC的表達與計數(shù)[4]400倍光鏡下觀察，表皮、真皮內(nèi)以細胞質(zhì)和/或細胞膜著色呈褐色并有樹突狀突起的細胞為CD1a+LC，每張切片隨機選取5個視野計數(shù)CD1a+LC細胞數(shù)和細胞總數(shù)，CD1a+LC密度=5個視野CD1a+LC細胞總數(shù)/5個視野總細胞數(shù)。

1.3.2.2 MCP-1的表達及半定量計分[5]400倍光鏡下觀察，以細胞質(zhì)和/或細胞膜有棕褐色到淡黃色顆粒著色者為MCP-1陽性細胞，表達強度采用基于染色強度和陽性細胞百分率的半定量計分法。染色強度計分（A）：棕褐色計3分，棕黃色計2分，淡黃色計1分，未著色計0分；陽性細胞百分率計分（B）：≥66%的表皮細胞著色計3分；33%～65%的表皮細胞著色計2分；＜33%的表皮細胞著色計1分。MCP-1的表達強度為A×B。每張切片隨機選取5個視野進行陽性細胞觀察并予以半定量計分，取平均值作為400倍光鏡下每個視野內(nèi)MCP-1表達半定量計分結(jié)果（表達強度）。

1.4 觀察指標 觀察并比較BP皮損組織與皮損旁正常皮膚組織中CD1a+LC的形態(tài)、密度與MCP-1的表達情況，并分析CD1a+LC密度與MCP-1表達強度的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BP皮損組織與皮損旁正常皮膚組織中CD1a+LC的形態(tài)、密度比較 CD1a分子主要表達于表皮棘層的樹突狀細胞，為細胞質(zhì)褐色顆粒樣著色，即為LC。BP皮損組織中CD1a+LC細胞體較小，突起明顯減少、縮短，結(jié)果見圖1a；而皮損旁正常皮膚組織中可見較多CD1a+LC，分布均勻，細胞體不規(guī)則，多數(shù)有較多較長樹枝狀胞突，結(jié)果見圖1b。BP皮損組織中CD1a+LC密度為0.027±0.016，皮損旁正常組織中CD1a+LC密度為0.053±0.023，BP皮損組織中CD1a+LC密度明顯低于皮損旁正常組織（P＜0.05）。

圖1 BP皮損組織與皮損旁正常皮膚組織中CD1a+LC的形態(tài)比較（SP法，×400）

2.2 BP皮損組織與皮損旁正常皮膚組織中MCP-1的表達情況比較 MCP-1蛋白主要表達在表皮角質(zhì)形成細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，皮損組織中MCP-1染色以棕黃色至淡黃色為主，結(jié)果見圖2a；皮損旁正常組織中MCP-1染色強度以棕褐色到棕黃色為主，結(jié)果見圖2b。BP皮損組織中MCP-1的表達強度為2.361±1.710，皮損旁正常皮膚組織中MCP-1的表達強度為 4.833±2.324，MCP-1在BP皮損組織中的表達強度比在皮損旁正常皮膚中的表達強度明顯降低（P＜0.05）。

圖2 BP皮損組織與皮損旁正常皮膚組織中MCP-1的表達情況比較（SP法，×400）

2.3 BP皮損組織與皮損旁正常皮膚組織中CD1a+LC密度與MCP-1表達強度的相關(guān)性分析 MCP-1在BP皮損組織中表達強度較低，CD1a+LC密度也較低，兩者呈正相關(guān)（r=0.372，P＜0.05），結(jié)果見圖3。MCP-1在皮損旁正常皮膚組織中表達強度相對較高，且CD1a+LC密度也相對高，兩者亦呈正相關(guān)（r=0.384，P＜0.05），結(jié)果見圖4。

圖3 BP皮損組織中CD1a+LC密度與MCP-1表達強度的散點圖

圖4 皮損旁正常皮膚組織中CD1a+LC密度與MCP-1表達強度的散點圖

3 討論

BP作為一種具有獨立臨床、病理特征的疾病，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，BP發(fā)病機制研究因而被日益重視。LC是皮膚和黏膜內(nèi)識別、處理和遞呈抗原的專職免疫細胞，在HPV的免疫清除等方面具有特別重要的意義[6]。研究報道，HPV感染導(dǎo)致的宮頸癌[7]、鱗狀細胞癌[8]等病變組織中LC受抑制，細胞數(shù)量減少，分布、形態(tài)等發(fā)生異常。

本研究檢測了36例BP皮損和皮損旁正常皮膚組織中LC標志性抗原分子CD1a的表達，觀察BP皮損組織中CD1a+LC分布密度和形態(tài)變化。與皮損旁正常皮膚組織相比，BP皮損組織中CD1a+LC密度降低，細胞體較小，突起明顯減少、縮短。這提示BP皮損中LC數(shù)量下降、形態(tài)出現(xiàn)異常，可能導(dǎo)致LC的功能受損，如LC攝取表皮細胞內(nèi)HPV抗原并向真皮淋巴結(jié)T細胞遞呈抗原的能力下降，進而可能是BP病情反復(fù)或長期不愈的原因之一。

BP皮損局部LC密度和形態(tài)改變的機制目前尚未完全闡明。LC來源于骨髓，經(jīng)血液/真皮遷移進入表皮。研究顯示LC能否順利進入表皮與表皮局部免疫微環(huán)境中細胞因子[9]，特別是趨化因子的誘導(dǎo)密切相關(guān)[10]。Caberg等[11]研究報道HPV感染引起的鱗狀上皮病變中，LC的數(shù)量減少、功能受損。LC在病變局部的浸潤受抑與環(huán)境中趨化因子缺乏有關(guān)。Feng等[12]研究發(fā)現(xiàn)HPV感染導(dǎo)致尖銳濕疣中LC數(shù)量減少的同時，形態(tài)亦出現(xiàn)異常，并認為LC形態(tài)的異?？赡芘c上皮細胞產(chǎn)生的細胞因子影響LC成熟有關(guān)。

CC型趨化因子MCP-1主要由單核巨噬細胞、成纖維細胞等分泌產(chǎn)生，對LC的遷移和分化成熟，促進體內(nèi)免疫微環(huán)境形成，誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答等有重要作用[13]。Harada等[14]報道在免疫性膽道疾病中膽管上皮內(nèi)LC的聚集與MCP-1在該處的表達有關(guān)。Ouwehand等[15]研究報道皮膚中使用MCP-1中和抗體能抑制LC的遷移。Kleine-Lowinski等[16]研究報道MCP-1的表達下調(diào)，可能導(dǎo)致宮頸上皮細胞對HPV的免疫耐受，從而促進宮頸癌的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，BP皮損組織中MCP-1染色淡，表達范圍小，與皮損旁正常皮膚組織相比，MCP-1的表達強度下降。且BP皮損及皮損旁正常皮膚組織中，LC細胞密度與MCP-1表達強度均呈明顯正相關(guān)。這提示BP皮損局部MCP-1的表達可能受抑制，使得機體免疫微環(huán)境中趨化LC向表皮HPV感染部位聚集的作用被減弱，可能是造成皮損局部LC密度降低的原因之一。

HPV感染引起MCP-1表達受抑制的具體機制尚不完全清楚。Hacke等[17]報道HPV感染引起的癌前病變以及惡變組織中，HPV通過影響p53進而抑制MCP-1的轉(zhuǎn)錄表達以及趨化細胞的功能。Sperling等[18]研究報道HPV8的E7蛋白通過轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ途徑可抑制由角質(zhì)形成細胞分泌與MCP-1同類的趨化因子CCL20的表達，進而影響了LC遷移。

綜上所述，BP皮損組織中，HPV可能通過下調(diào)宿主MCP-1表達，使得皮損局部LC密度下降。此外MCP-1具有趨化單核巨噬細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞向炎性病變部位聚集、并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分泌黏附分子的能力亦減弱，使得這些細胞和細胞因子對LC功能的協(xié)同作用減弱，引起LC對HPV作出免疫應(yīng)答的能力下降。LC在無法正常攝取HPV抗原的同時，分化成熟亦發(fā)生障礙，進一步造成抗原遞呈功能障礙，最終導(dǎo)致機體免疫功能受抑制，難以形成對HPV有效的免疫應(yīng)答，造成HPV持續(xù)感染。這些改變與BP的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)等病理過程密切相關(guān)。隨著研究的深入，如能良好調(diào)控表皮局部MCP-1等趨化因子的表達水平，有效誘導(dǎo)LC向表皮遷移，可能在逆轉(zhuǎn)BP免疫功能異常等醫(yī)學(xué)難題方面產(chǎn)生積極影響。

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