陳 煒，周亞竟

(江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院，鎮(zhèn)江 212013)

每天細(xì)胞內(nèi)僅因內(nèi)源因素(如活性氧自由基、代謝產(chǎn)物等)就會(huì)引起高達(dá)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA損傷，每個(gè)損傷均可導(dǎo)致復(fù)制叉進(jìn)程受阻，這些阻礙可以通過(guò)各種損傷修復(fù)途徑得以克服，或通過(guò)損傷耐受機(jī)制激活跨損傷合成(Translesion synthesis, TLS)聚合酶，在損傷DNA加成物(adduct)對(duì)稱新鏈的相應(yīng)位置加上核苷酸，或通過(guò)模板交換而旁路繞過(guò)這些損傷。相較于RNA、蛋白質(zhì)、代謝物等，DNA位于信息傳遞的頂層，是細(xì)胞內(nèi)唯一無(wú)法被取代的大分子，因此，損傷的DNA完全依賴于修復(fù)。如果這些損傷未能被及時(shí)修復(fù)或被不正確的修復(fù)，將引起基因突變、錯(cuò)誤插入、刪除、或者染色體紊亂，最終導(dǎo)致人類多種疾病的發(fā)生。因此，準(zhǔn)確的DNA復(fù)制和及時(shí)的損傷修復(fù)在真核生物維持其染色體穩(wěn)定、防止遺傳變異和人類多種疾病，特別是癌癥的發(fā)生等方面起著極其重要的作用。

1 DNA聚合酶Pol δ與染色體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)

生命的本質(zhì)在于遺傳信息從上代到下代的正常傳遞，生物體在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展出一套精確機(jī)制以保證“忠實(shí)”的DNA復(fù)制。真核生物染色體DNA復(fù)制主要由3種B-家族復(fù)制性聚合酶(Replicative polymerases)來(lái)完成，即：聚合酶α、δ和ε(Pol α、Pol δ和 Pol ε)，當(dāng)雙螺旋親代DNA分子解鏈后，Pol α/primase分別在復(fù)制叉的前導(dǎo)鏈和滯后鏈上合成一小段低保真度的RNA/DNA引物而啟動(dòng)DNA的合成，復(fù)制叉上的分工實(shí)驗(yàn)表明，在前導(dǎo)鏈(Leading strand)上主要是由Pol ε來(lái)主導(dǎo)子代DNA的合成，而在滯后鏈(Lagging strand)上則是由Pol δ來(lái)完成[1]。但也有觀點(diǎn)認(rèn)為，Pol δ可能均參與了兩條鏈上子代DNA的合成過(guò)程[2]，但是，目前還不清楚體內(nèi)(in vivo)這兩種復(fù)制聚合酶在復(fù)制叉上的具體分工和明確的復(fù)制機(jī)制。

Pol δ作為一個(gè)同時(shí)擁有5′-3′聚合酶催化活性和3′-5′核酸外切酶活性(框架閱讀校對(duì)功能，prof-reading)的高保真聚合酶，除了通過(guò)它的高度復(fù)制保真特性在染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和避免遺傳變異方面扮演關(guān)鍵角色外，幾乎所有的DNA修復(fù)過(guò)程均涉及Pol δ的參與，如：Pol δ通過(guò)鏈上置換(Strand displacement)機(jī)制協(xié)同F(xiàn)en-1在錯(cuò)配修復(fù)途徑(Mismatch repair)中起重要作用，此過(guò)程需要p68亞基的參與[3]。在跨損傷修復(fù)途徑中，Pol δ和特定的TLS聚合酶通過(guò)一種聚合酶轉(zhuǎn)換機(jī)制(Polymerases switching mechanism)來(lái)完成跨損傷合成。一般觀點(diǎn)認(rèn)為，X-家族聚合酶Pol β是負(fù)責(zé)堿基切除修復(fù)(Base excision repair, BER)最主要的修復(fù)聚合酶，但本實(shí)驗(yàn)室和其他同行的研究表明，Pol δ在BER途徑中扮演著關(guān)鍵角色[4-5]。大量研究也表明，Pol δ通過(guò)DNA的重新合成和缺口填補(bǔ)在核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair, NER)以及雙鏈斷裂修復(fù)的同源重組(Homologous recombination, HR)途徑中也起著重要作用[6]。

2 真核生物DNA聚合酶Pol δ 的結(jié)構(gòu)與功能

通過(guò)對(duì)人源、酵母(S.pombe和S.cerevisiae)Pol δ在遺傳學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域的大量研究，目前對(duì)真核生物Pol δ的結(jié)構(gòu)和功能已有了較充分的了解。類似于S.pombe的Pol δ(各亞基分別為：Pol3、Cdc1、Cdc27、Cdm1)，人源Pol δ也是由4個(gè)亞基組成的異源四聚體(各亞基分別為：p125、p50、p68、p12)，而在釀酒酵母S.cerevisiae中尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的第4亞基，由前3種亞基(Pol3p、Pol31p、Pol32p)構(gòu)成異源三聚體。根據(jù)2001年發(fā)表的真核生物Pol δ亞基統(tǒng)一命名法，真核生物Pol δ的催化亞基被命名為A-亞基，其它3個(gè)輔助亞基分別為B-、C-、D-亞基[7]。

圖1 酵母S.cerevisiae Pol3p-DNA-dCTP三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)卡通示意圖[8]Fig 1 Crystal structure of the Pol3p-DNA-dCTP ternary complex of S.cerevisiae

酵母S.cerevisiaeA-亞基催化核心域的“手掌”“手指”“拇指”、核酸外切酶、N-端域分別以青、黃、橙、洋紅、深藍(lán)顏色表示，DNA以灰色表示；模板上G和即將加入的dCTP以紅色表示，鈣離子以綠色表示，催化(Pol)和核酸外切(Exo)活性中心如箭頭所指

目前還沒(méi)有人源A-亞基p125晶體三維結(jié)構(gòu)分析信息的報(bào)道，但通過(guò)對(duì)S.cerevisiaePol δ的A-亞基(Pol3p)催化核心域(catalytic core)與模板/引物及嵌入dCTP核苷酸所形成的三元復(fù)制復(fù)合物晶體進(jìn)行的三維結(jié)構(gòu)分析如圖1所示[8]，其催化核心域具有如所有已知的DNA聚合酶所特有的右手型構(gòu)象，在C-端域(C-terminal domain, CTD)的非結(jié)構(gòu)化“拴繩”(an unstructured tether)末端含有一個(gè)富含半胱氨酸域和一個(gè)亞域，這個(gè)亞域?qū)εcB-亞基的互作反應(yīng)至關(guān)重要[9]，也就是說(shuō)，B-亞基與A-亞基CTD的亞域發(fā)生捆綁反應(yīng)；而富含半胱氨酸域構(gòu)成兩個(gè)鋅指基序ZnF1和ZnF2，其ZnF1對(duì)A-亞基與增殖細(xì)胞核抗原PCNA的捆綁及介導(dǎo)Pol δ的持續(xù)合成至關(guān)重要。

由人源B-亞基p50與C-亞基p68 N-末端殘基形成的復(fù)合物晶體三維結(jié)構(gòu)分析顯示[10]，p50亞基顯示有較大的、約12 868 ?2磷酸二酯酶狀(Phosphodiesterase-like, PDE)的表面結(jié)構(gòu)域，且含有許多突出部和柔性回路，這使得p50亞基特別適合作為對(duì)接平臺(tái)連接其它亞基和眾多調(diào)控蛋白；又由于構(gòu)成p50亞基PDE結(jié)構(gòu)域的雙β-折疊(β-sheet)之一通過(guò)平行的β-股(β-strands)與p68的β-折疊相連，形成擴(kuò)展了的β-折疊，因此，p68 N-端可以看作是p50亞基的延伸。B-亞基p50作為一個(gè)理想的“腳手架”(Scaffold)，除了鏈接其它3個(gè)亞基外，還可以通過(guò)延伸的C-亞基介導(dǎo)Pol δ在復(fù)制調(diào)控、跨損傷修復(fù)、中斷復(fù)制(Break-induced replication, BIR)等過(guò)程中的功能[11]。

對(duì)人源p12亞基而言，它同時(shí)與p125的CTD域和p50亞基捆綁而形成穩(wěn)定的三角結(jié)構(gòu)，p12起到穩(wěn)定Pol δ空間結(jié)構(gòu)的功能[12]。因此，真核生物Pol δ復(fù)合體的結(jié)構(gòu)被確定為：A-、B-、D-亞基相互“捆綁”形成穩(wěn)定的三角結(jié)構(gòu)，而C-亞基只能和B-亞基發(fā)生“捆綁”反應(yīng)，形成B-亞基的延伸。

Pol δ作為染色體DNA復(fù)制功能的研究總是和PCNA相關(guān)聯(lián)，此時(shí)，3個(gè)PCNA分子形成三聚體的環(huán)狀滑行夾協(xié)同Pol δ的復(fù)制功能，同時(shí)，PCNA作為對(duì)接平臺(tái)功能，通過(guò)募集-離散相關(guān)蛋白(復(fù)合體)，在各種DNA的損傷修復(fù)過(guò)程也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。所有的Pol δ 4個(gè)亞基均被報(bào)道含PCNA捆綁反應(yīng)域與PCNA發(fā)生捆綁反應(yīng)，其中以p68與PCNA反應(yīng)最強(qiáng)，而p50與PCNA的反應(yīng)最弱[13]。在我們?cè)?jīng)提出過(guò)的(如圖2)Pol δ-PCNA復(fù)制復(fù)合體分子反應(yīng)模型中，p125、p68和p12 3個(gè)亞基分別與三聚體PCNA中一個(gè)分子起反應(yīng)，當(dāng)缺失了p12亞基時(shí)，p50亞基有可能成為與PCNA反應(yīng)的備選分子。但由于p50與PCNA的親和能力太過(guò)微弱以及Pol δ復(fù)合體空間結(jié)構(gòu)的改變，p50亞基也可能無(wú)法與PCNA反應(yīng)，使得三聚體中空出一個(gè)PCNA分子。在某些場(chǎng)合，如DNA的損傷應(yīng)答，空出的這個(gè)PCNA分子是否可能作為對(duì)接平臺(tái)的功能，通過(guò)募集其它修復(fù)蛋白，如Y-家族聚合酶等，參與到DNA的損傷修復(fù)過(guò)程等，均有待進(jìn)一步深入研究。

圖2 人源Pol δ-PCNA復(fù)制復(fù)合物的蛋白-蛋白互作反應(yīng)模型Fig 2 A model of the network of protein-protein interactions for human Pol δ-PCNA complexes

A：由四亞基與PCNA構(gòu)成的復(fù)制復(fù)合物Pol δ4-PCNA。Pol δ內(nèi)部各亞基之間以及PCNA三聚體之間的反應(yīng)以實(shí)線表示，而各亞基與PCNA之間的反應(yīng)以三實(shí)線表示。B：由缺失了p12亞基的三亞基與PCNA構(gòu)成的復(fù)制復(fù)合物Pol δ3-PCNA。p50可能提供一個(gè)與PCNA反應(yīng)的備選分子，但也可能由于親和能力太過(guò)微弱而無(wú)法與PCNA發(fā)生互作反應(yīng)，使得三聚體中空出一個(gè)PCNA分子以備他用。本圖源自文獻(xiàn)[13]并作相應(yīng)修改

3 跨損傷修復(fù)途徑中Pol δ 與TLS聚合酶轉(zhuǎn)換機(jī)制的激活

盡管復(fù)制性DNA聚合酶Pol δ具有緊湊縝密的催化活性中心和3′-5′核酸外切酶活性的框架閱讀功能以保證DNA復(fù)制的高度持續(xù)合成能力和高保真性，DNA還是易受到各種內(nèi)源或外源因素導(dǎo)致的損傷，據(jù)估計(jì)每天僅因內(nèi)源因素就會(huì)產(chǎn)生數(shù)以萬(wàn)計(jì)的損傷[14]。為維護(hù)染色體DNA結(jié)構(gòu)的完整性和遺傳穩(wěn)定性，細(xì)胞被賦予一整套如前面所提及的各種復(fù)雜的修復(fù)途徑，以便在復(fù)制啟動(dòng)前消除這些損傷，但是，還是有相當(dāng)數(shù)量的損傷會(huì)逃逸這些精確設(shè)計(jì)的修復(fù)途徑而存在于基因組中，使得細(xì)胞S-期復(fù)制叉進(jìn)程“熄火”、染色體異常甚至細(xì)胞死亡，因此，細(xì)胞進(jìn)化出一種“旁路通過(guò)”(by-pass)受損DNA的損傷耐受機(jī)制(或稱為復(fù)制后修復(fù)機(jī)制，DNA damage tolerance, DDT)來(lái)恢復(fù)DNA的正常復(fù)制，避免這些逃逸了的損傷所致的影響。一種損傷耐受機(jī)制涉及模板交換的無(wú)錯(cuò)(error-free)途徑，即：利用無(wú)損的姐妹鏈，而不是損傷鏈作模板繼續(xù)DNA的復(fù)制[15]；另一種被廣泛深入研究的是有錯(cuò)的(error-prone)TLS修復(fù)途徑，TLS聚合酶在模板的損傷點(diǎn)對(duì)面加入核苷酸以延伸引物，但不修復(fù)這些損傷，即所謂的“旁路通過(guò)”，這雖然增加了復(fù)制錯(cuò)誤的頻率，卻能夠使S-和G2-期的復(fù)制叉進(jìn)程得以恢復(fù)[16]。

哺乳動(dòng)物介導(dǎo)跨損傷合成的主要聚合酶包括Y-家族的4個(gè)成員(REV1、Pol η、Pol ι 和Pol κ)以及B-家族成員之一的Pol ζ，有別于復(fù)制聚合酶，這些TLS聚合酶的催化活性中心比較松弛，能夠容納畸變了的損傷堿基，且持續(xù)合成能力低，不含3′-5′核酸外切酶活性的框架閱讀能力[17]。當(dāng)復(fù)制進(jìn)程遇到損傷點(diǎn)(域)時(shí)，復(fù)制暫停，TLS聚合酶被募集并取代復(fù)制體(replisome)中Pol δ，在完成跨損傷合成后離開，Pol δ重新被募集回到引物末端繼續(xù)新的合成，這就是有錯(cuò)TLS修復(fù)途徑的一個(gè)關(guān)鍵步驟——聚合酶轉(zhuǎn)換機(jī)制，但對(duì)在損傷點(diǎn)(域)聚合酶如何進(jìn)行轉(zhuǎn)換的機(jī)制存在爭(zhēng)議。有觀點(diǎn)認(rèn)為，在Pol δ和Pol ζ介導(dǎo)的跨損傷修復(fù)中是通過(guò)催化亞基共享輔助亞基在損傷點(diǎn)(域)進(jìn)行了轉(zhuǎn)換[18]，但這種模型無(wú)法解釋其它TLS聚合酶在損傷點(diǎn)(域)與Pol δ是如何進(jìn)行交換的。

通過(guò)對(duì)PCNA泛素化修飾及修飾后調(diào)控真核細(xì)胞應(yīng)對(duì)DNA損傷的深入研究，另外的觀點(diǎn)認(rèn)為，是PCNA的泛素化-去泛素化修飾介導(dǎo)了TLS修復(fù)途徑的聚合酶轉(zhuǎn)換。酵母中，PCNA在K164殘基位點(diǎn)被Rad6/Rad18綴合酶-連接酶(E2/E3)泛素反應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)單泛素化修飾(這里，以PCNA-Ub1表示被單泛素化修飾了的PCNA)，在Pol η 和Pol ζ介導(dǎo)的跨損傷修復(fù)途徑中扮演重要角色[19]，PCNA-Ub1特異性地與Pol η發(fā)生親和結(jié)合，但未經(jīng)修飾的PCNA則不能[20]，PCNA-Ub1能夠特異性激活Pol η和REV1，促進(jìn)跨損傷合成[21]。所有的TLS聚合酶C-末端存在高度進(jìn)化保守的泛素結(jié)合域UBM(Ubiquitin-binding motif)或泛素結(jié)合鋅指UBZ(Ubiquitin-binding zinc finger)，TLS聚合酶通過(guò)UBM和UBZ與單泛素化了的PCNA-Ub1親和結(jié)合被募集到損傷區(qū)的復(fù)制點(diǎn)，在沒(méi)有DNA損傷情況下，PCNA的單泛素化修飾被去泛素化酶USP1所抑制，復(fù)制性聚合酶Pol δ和TLS聚合酶之間的轉(zhuǎn)換被阻止，一旦發(fā)生DNA損傷，TLS途徑被激活，PCNA的單泛素化修飾調(diào)控TLS聚合酶在損傷點(diǎn)(域)的募集[22]。

4 跨損傷修復(fù)途徑中可能存在未知的聚合酶轉(zhuǎn)換激活機(jī)制

盡管“Pol δ-TLS聚合酶之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換是跨損傷修復(fù)途徑的核心”已成目前為被廣泛接受的觀點(diǎn)，但對(duì)“PCNA單泛素化-去泛素化修飾介導(dǎo)了聚合酶的交換”存在爭(zhēng)議。相反的研究表明，組成分子環(huán)狀滑行夾的3個(gè)PCNA分子能夠同時(shí)被單泛素化修飾，值得注意的是，單泛素化了的PCNA-Ub1并不影響復(fù)制聚合酶Pol δ的活性，也未破壞Pol δ-PCNA的捆綁結(jié)構(gòu)，對(duì)TLS聚合酶Pol η的活性無(wú)增強(qiáng)作用；無(wú)論是未經(jīng)修飾的PCNA還是泛素化了的PCNA-Ub1，它們對(duì)TLS聚合酶Pol ζ 和REV1的活性均并無(wú)任何刺激作用，因此，這些研究指出，在損傷點(diǎn)(域)，Pol δ并不是通過(guò)PCNA被TLS聚合酶取代，PCNA的單泛素化修飾并不是構(gòu)成聚合酶轉(zhuǎn)換的核心，而可能是通過(guò)其它的某些未知功能而影響著TLS進(jìn)程，推測(cè)可能是某個(gè)Pol δ相關(guān)的未知因子介導(dǎo)了TLS聚合酶在損傷點(diǎn)的募集[22-24]。

人源和酵母PCNA-Ub1晶體三維結(jié)構(gòu)的X-衍射分析均顯示PCNA和泛素的結(jié)構(gòu)與它們結(jié)合前的游離形式幾乎沒(méi)有太大區(qū)別。人源PCNA結(jié)構(gòu)卡通模型如圖3所示，被Rad6/Rad18介導(dǎo)單泛素修飾的賴氨酸殘基K164位于PCNA環(huán)狀滑行夾的背面，而DNA合成則是在滑行夾的正面發(fā)生，即沿著引物的5′→3′前進(jìn)方向進(jìn)行。

所有的真核Y-家族聚合酶均含有非規(guī)范的(non-canonical)PIP盒(REV1除外，它通過(guò)自身BRCT域與PCNA發(fā)生反應(yīng))，TLS聚合酶通過(guò)它們的PIP盒與PCNA發(fā)生親和反應(yīng)。TLS聚合酶PIP盒肽段與PCNA捆綁的晶體結(jié)構(gòu)分析表明，Pol η的PIP盒與PCNA的親和能力要比其UBZ域與PCNA-Ub1上泛素分子的親和能力要強(qiáng)得多[22,26]。因此，在遇到損傷時(shí)，TLS聚合酶不太可能通過(guò)親和能力較弱的UBM或UBZ域與環(huán)狀滑行夾背面的泛素發(fā)生親和而被募集到PCNA環(huán)狀滑行夾正面朝向的損傷點(diǎn)(域)與Pol δ發(fā)生交換。這也從另一個(gè)側(cè)面證明了由PCNA的泛素化修飾激活聚合酶轉(zhuǎn)換機(jī)制的可能性較低。

圖3 人源PCNA三維結(jié)構(gòu)的卡通模型Fig 3 Crystal structure of human PCNA

A：?jiǎn)畏肿覲CNA由N-端(灰色)和C-端(綠色)的兩個(gè)獨(dú)立域組成，兩個(gè)獨(dú)立域之間通過(guò)域間連接環(huán)(interdomain connecting loop，IDCL)相連(洋紅)，164位的賴氨酸殘基(K164)以紅色球狀表示。B和C：分別表示三聚體PCNA的正視圖和側(cè)視圖，3個(gè)PCNA單分子頭尾相連，構(gòu)成顯著不同的兩個(gè)面，由C-端凸出部構(gòu)成的一面被稱為正面(Front side)，或稱C-端面(C-terminal face)。側(cè)視圖顯示這兩個(gè)面的顯著不同，右向的正面(C-端面)含IDCL，在正常DNA合成過(guò)程負(fù)責(zé)與復(fù)制性聚合酶的反應(yīng)，而發(fā)生單泛素化修飾的K164位于左向的背面。本圖源自文獻(xiàn)[25]并作相應(yīng)修改

5 展望

前期的研究表明，在人源細(xì)胞幾乎所有的、由各種因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA損傷中，Pol δ均以缺失了p12亞基的三聚體形式Pol δ3以應(yīng)對(duì)，且鑒定出兩種能夠介導(dǎo)p12經(jīng)多聚泛素化-蛋白酶體途徑降解的E3連接酶RNF8和CRL4Cdt2[27-29]。我們的最新研究還發(fā)現(xiàn)，RNF8還能夠介導(dǎo)Pol δ的p50亞基被單泛素化修飾(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。然而，細(xì)胞內(nèi)的p50亞基通過(guò)什么E2/E3泛素化修飾調(diào)控系統(tǒng)被單泛素化修飾？修飾后的p50在缺失了p12亞基的Pol δ三聚體中扮演什么角色？與TLS聚合酶的互作關(guān)系？在跨損傷合成途徑中如何調(diào)控Pol δ與TLS聚合酶之間的轉(zhuǎn)換？這些問(wèn)題將成為我們今后需要進(jìn)行研究的重點(diǎn)。

癌癥是一種由遺傳和表觀遺傳改變、以細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)的一大類疾病，DNA修復(fù)功能缺陷是許多自發(fā)性腫瘤和遺傳性癌癥的主要特征之一；與早(衰)老癥相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因鼠模型研究還表明，未修復(fù)的DNA損傷積累也與早(衰)老癥及老年性疾病密切相關(guān)，最終闡明跨損傷合成途徑聚合酶Pol δ與TLS聚合酶交換機(jī)制，將為今后以Pol δ作為一種小分子抑制劑潛在的新靶標(biāo)、設(shè)計(jì)新的腫瘤診斷方法和治療手段來(lái)抗擊癌癥、防治衰老等相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

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