孫慧偉，謝輝，李瑞生，李曉娟，柴燕濤，姜棋予，王志杰，楊銳創(chuàng)，馮帆，侯俊

解放軍第三〇二醫(yī)院 a.臨床研究管理中心；b.介入科；北京 100039

原發(fā)性肝臟腫瘤主要包括肝細(xì)胞癌（hepato?cellularcar cinoma，HCC）和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intra?hepatic cholangiocarcinoma，IHC）2個病理分型[1-2]，其中HCC是主要的病理類型。絕大多數(shù)HCC患者初診即為進(jìn)展期（advancedHCC），失去外科手術(shù)等根治性治療機(jī)會[3-4]。HCC細(xì)胞對放射治療不敏感[5]，同時具有對各種細(xì)胞毒性化療藥物的多藥耐受（multi-drug resistance，MDR）特性[6]，而惟一的肝細(xì)胞癌一線治療藥物——口服多靶標(biāo)蛋白激酶抑制劑索拉菲尼（sorafenib）的臨床獲益?zhèn)€體差異極大，只有25%～40%的HCC患者對其有應(yīng)答，隨著治療的進(jìn)展，大多數(shù)對索拉非尼初始敏感的患者也會出現(xiàn)耐藥[7]。目前，以經(jīng)導(dǎo)管動脈化學(xué)栓塞TACE（transcatheter arterial chemoem?bolization，TACE）為代表的介入治療策略在肝臟腫瘤診療中具有重要意義，能夠起到延緩疾病進(jìn)展，降低患者腫瘤負(fù)荷，提高生存質(zhì)量的作用[8-10]。但另一方面，介入治療也有可能作為強(qiáng)有力的殺傷因素，破壞腫瘤組織的構(gòu)架或微環(huán)境，造成腫瘤細(xì)胞逃逸或散逸[11]；或作為脅迫因素，誘導(dǎo)和活化肝臟腫瘤細(xì)胞中各種脅迫應(yīng)答機(jī)制，發(fā)揮對治療的耐受或最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)[11]。

我們在臨床診療中已觀察到，相當(dāng)比例的肝臟腫瘤患者經(jīng)介入治療后，無論是否接受手術(shù)切除，都會出現(xiàn)多發(fā)性甚至彌散性復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[12]。這一現(xiàn)象嚴(yán)重危害患者健康，影響臨床診療效果，但相關(guān)機(jī)制尚不清楚，也沒有對接受物理性局部治療的肝臟腫瘤患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與侵襲等預(yù)后進(jìn)行檢測、判別或預(yù)測的方法。為解決這一問題，我們采用經(jīng)TACE治療的肝臟腫瘤患者手術(shù)切除或內(nèi)窺鏡引導(dǎo)下的手術(shù)切除標(biāo)本，建立免疫缺陷動物（SICD小鼠）的肝臟原位腫瘤模型，通過B超探測和H&E、Masson染色等病理學(xué)分析方法對原位HCC病灶進(jìn)行腫瘤的侵潤性生長，腫瘤侵襲與腫瘤血道轉(zhuǎn)移分析，最終判別和預(yù)測HCC的預(yù)后風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 材料

對肝臟腫瘤患者進(jìn)行行為評分，選取接受物理性局部策略進(jìn)行降階梯治療的患者，若治療后其行為評分好轉(zhuǎn)，則接受開腹手術(shù)切除或腹腔內(nèi)窺鏡引導(dǎo)的肝臟腫瘤切除手術(shù)，使用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基保存標(biāo)本外層性狀較好的部分。

SCID小鼠（C.B-17/lcr）由北京市斯貝福生物科技有限公司提供；吸入麻醉劑異氟烷為深圳沃瑞德公司產(chǎn)品；小動物實驗相關(guān)全套設(shè)備與手術(shù)器械由本實驗室保存；病理實驗H&E染色試劑盒與Masson染色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 免疫缺陷小鼠肝臟原位模型的建立[13]

免疫缺陷（T、B細(xì)胞雙重缺失）雌性5～6周齡C.B-17/lcr品系SCID小鼠，在潔凈空間（SPE飼養(yǎng)條件）用60Co-γ照射除菌的墊料和飼料飼養(yǎng)。以異氟烷為麻醉劑，用麻醉機(jī)持續(xù)麻醉（首次麻醉時異氟烷濃度為3.5%，持續(xù)麻醉時異氟烷濃度為1.5%～2.0%）。將小鼠固定于粘鼠板上，在其腹部劍突下方剪開一個約1cm的開口，輕輕擠出肝右葉，用眼科鑷在肝葉表面制造孔洞后用滅菌棉簽按壓止血。剝?nèi)∧[瘤標(biāo)本外層生發(fā)層活性較好的組織，切成小塊（直徑1～1.5mm）后將腫瘤組織接種進(jìn)肝葉的孔洞內(nèi)，確定借種成功后按壓止血。將肝葉推回腹腔內(nèi)，縫合創(chuàng)口，注意縫合的層次，縫合3～4針即可。如有少量出血則進(jìn)行按壓止血。

1.3 原位腫瘤的B超探查[13]

前述免疫缺陷動物經(jīng)過4周左右生長后，用深圳開立生物醫(yī)療有限責(zé)任公司的S40型B超設(shè)備，使用配套的L742型小器官超聲探頭進(jìn)行常規(guī)B超探查，在右肝葉探查得到1～1.5mm的低回聲病灶時即可進(jìn)行病理檢測。

1.4 H&E染色檢測

染液配制：①伊紅酒精溶液（1%）：稱取伊紅Y染料1g，加入少量蒸餾水溶解后，逐滴加入冰醋酸直至染料為糊狀，用濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，用100mL95%酒精溶解；②蘇木素染液：稱取蘇木精6g，溶于100mL無水乙醇，再將150g硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶液再與900mL甘油混合，最后加入120mL冰醋酸和1.2g碘酸鈉3即可；③分化液：將1mL濃鹽酸加入99mL 70%酒精中即可。

剝離前述免疫缺陷小鼠的肝右葉，用4%多聚甲醛固定24h后進(jìn)行包埋、切片等常規(guī)操作。獲得的石蠟切片分別用二甲苯Ⅰ（15min）、二甲苯Ⅱ（15min）、1∶1二甲苯/無水乙醇（2min）、無水乙醇Ⅰ（5min）、無水乙醇Ⅱ（5min）、80%乙醇（5min）及蒸餾水（5min）依次處理脫蠟復(fù)水后，用蘇木精液染色（5min），水洗10min或流水沖洗5min，再用1%鹽酸乙醇分化30s后水洗30s、蒸餾水過洗5s，用伊紅液染色 1～3min，再分別用蒸餾水（30s）、80%乙醇（30s）、95%乙醇（1min）、95%乙醇（1min）、無水乙醇Ⅰ（3 min）、無水乙醇Ⅱ（3min）、二甲苯Ⅰ（3min）、二甲苯Ⅱ（3min）脫水后，用中性樹膠封片。將經(jīng)H&E染色的病理切片在顯微鏡下檢測并拍照，識別腫瘤組織的特性。

1.5 Masson染色檢測

染液配制：①蘇木素染液：稱取蘇木精6g，溶于100mL無水乙醇，再將150g硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶液再與900mL甘油混合，最后加入120mL冰醋酸和1.2g碘酸鈉3即可；②Masson立春紅酸性復(fù)紅液：稱取麗春紅0.7g、酸性復(fù)紅0.3g，量取冰醋酸1mL、蒸餾水99mL，充分混合后過濾即可；③0.2%冰醋酸水溶液：量取冰醋酸0.2mL溶于100mL蒸餾水；④1%磷鉬酸水溶液：稱取磷鉬酸1g溶于100mL蒸餾水；⑤苯胺藍(lán)水溶液：稱取苯胺藍(lán)2g、量取冰醋酸2mL，溶于98mL蒸餾水。

剝離前述免疫缺陷小鼠的肝右葉，用4%多聚甲醛固定24h后進(jìn)行包埋、切片等常規(guī)操作。獲得的石蠟切片分別用二甲苯Ⅰ（15min）、二甲苯Ⅱ（15min）、1∶1二甲苯/無水乙醇（2min）、無水乙醇Ⅰ（5min）、無水乙醇Ⅱ（5min）、80%乙醇（5min）及蒸餾水（5min）依次處理脫蠟復(fù)水后，用蘇木精液染色（5～10min），充分水洗（10min以上）或流水沖洗5min以上，用Masson立春紅酸性復(fù)紅液染色5～10min，再以2%冰醋酸水溶液洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)水溶液染5min后以2%冰醋酸水溶液洗片刻，最后分別用蒸餾水（30s）、80%乙醇（30s）、95%乙醇（1min）、95%乙醇（1min）、無水乙醇Ⅰ（3min）、無水乙醇Ⅱ（3min）、二甲苯Ⅰ（3min）、二甲苯Ⅱ（3min）等脫水后，以中性樹膠封片。將經(jīng)Masson染色的病理切片在顯微鏡下檢測并拍照，識別腫瘤組織的特性。

2 結(jié)果

2.1 H&E染色的病理學(xué)分析

我們對不同標(biāo)本在SCID小鼠肝臟形成的腫瘤組織進(jìn)行了H&E染色。由圖1可以看出，患者HCC手術(shù)切除標(biāo)本接種于免疫缺陷小鼠肝臟，經(jīng)過4周生長后形成的病灶（癌巢，nodules）能夠為H&E染色所確認(rèn)，可清晰地看到病灶和周圍正常組織。在此基礎(chǔ)上對其性狀進(jìn)行區(qū)分：圖1A為復(fù)發(fā)風(fēng)險小、預(yù)后程度好的患者，其手術(shù)切除標(biāo)本所形成的原位腫瘤界限清晰，癌巢（病灶）與其周圍組織有完整而清楚的界限或包膜；圖1B為復(fù)發(fā)風(fēng)險大、預(yù)后程度差的患者，其手術(shù)切除標(biāo)本所形成的原位腫瘤界限模糊，與周圍組織沒有清楚或明顯的界限。

2.2 Masson染色的病理學(xué)分析

我們用Masson染色對復(fù)發(fā)風(fēng)險大、預(yù)后程度差的患者臨床標(biāo)本在動物肝臟中形成的原位腫瘤進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖2，Masson染色能夠清晰直觀地顯示腫瘤的彌散性侵襲、遷移或侵潤性生長，對腫瘤組織的惡變程度進(jìn)行區(qū)分。圖2A示腫瘤呈侵潤性生長，可清晰辨識侵襲的腫瘤細(xì)胞，此時腫瘤組織惡變程度較輕；在此基礎(chǔ)上，用Masson染色能夠觀察到明顯的腫瘤細(xì)胞對正常組織構(gòu)架或微環(huán)境的破壞，誘導(dǎo)相應(yīng)組織重構(gòu)后產(chǎn)生并形成的腫瘤血管，腫瘤血管的管腔較大，且血管壁缺乏纖維甚至是正常上皮細(xì)胞（圖2B），侵襲和侵潤性生長的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)和參與形成內(nèi)皮不完整、纖維不發(fā)達(dá)的腫瘤血管，進(jìn)一步提示和反映了腫瘤的惡性程度；最后，部分標(biāo)本的Masson染色能夠觀察到明顯的血道轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（圖2C），肝臟主要血管的管腔較大，纖維豐富，且具備完整的管壁結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞通過主要血管的轉(zhuǎn)移顯示了其惡性強(qiáng)的轉(zhuǎn)移、侵襲能力?？梢钥闯?，肝臟的血管內(nèi)有經(jīng)由血管侵襲與侵潤性生長的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步反映出患者很高的復(fù)發(fā)風(fēng)險和較差的預(yù)后。

圖1 腫瘤組織標(biāo)本在SCID小鼠肝臟形成病灶的H&E病理學(xué)檢測

圖2 腫瘤組織標(biāo)本在SCID小鼠肝臟形成病灶的Masson病理學(xué)檢測

3 討論

以TACE為代表的各種介入治療已成為進(jìn)展期肝細(xì)胞癌診療的重要選擇，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷、縮小腫瘤，還可作為“降階梯”治療策略，減低患者腫瘤負(fù)荷并提高患者行為評分后進(jìn)行手術(shù)切除或接受肝臟移植[11]。隨著TACE等的廣泛應(yīng)用，其治療后的嚴(yán)重復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移報道日益增多。最近的報道顯示，以HCC為代表的人類惡性腫瘤細(xì)胞一般通過3種機(jī)制逃逸抗腫瘤治療進(jìn)而復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移：①TACE等抗腫瘤治療策略能夠作為脅迫因素誘導(dǎo)Survivin、cIAP1、cIAP2及BCL-2等抗凋亡、促存活蛋白表達(dá)，以此增加HCC細(xì)胞的抗性，促進(jìn)HCC細(xì)胞存活或治療耐受[14]；②如未能完全殺滅病變部位的全部HCC細(xì)胞，則有可能誘導(dǎo)殘存腫瘤細(xì)胞的上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），HCC細(xì)胞從偏向上皮特性轉(zhuǎn)向間質(zhì)特性，在這一過程（EMT）中其抗性和侵襲性顯著上調(diào)[14-15]；③實體腫瘤具有異質(zhì)性，TACE等抗腫瘤治療也有可能通過發(fā)揮克隆選擇的作用，促使病灶中相對靜止和極具抗性的一群細(xì)胞（即腫瘤干細(xì)胞相對富集，最終引起腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[11]。這提示我們，檢測TACE治療后腫瘤組織生物學(xué)行為、性狀的變化具有重要意義，有可能作為預(yù)測TACE治療后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的有效策略。

本研究選取SCID小鼠（C.B-17/lcr）品系進(jìn)行實驗。作為近年得到廣泛應(yīng)用的新型腫瘤動物模型，SCID小鼠的T細(xì)胞與B細(xì)胞均缺失，比裸鼠（T細(xì)胞缺失）具有更大的優(yōu)勢。TACE治療后的手術(shù)切除標(biāo)本或肝臟穿刺標(biāo)本，受手術(shù)或穿刺周期影響，HCC細(xì)胞的活性可能偏弱，SCID小鼠的應(yīng)用極大地改善了這一限制。

在研究中，H&E、Masson染色的觀測指標(biāo)明晰，圖像直觀且方法新穎。選取手術(shù)切除標(biāo)本外層性狀較好的部分接種免疫缺陷小鼠肝臟，B超探測原位癌巢直徑達(dá)到1～1.5mm時可進(jìn)行病理檢測。首先用H&E染色對腫瘤的性狀進(jìn)行初步判斷，再利用Masson染色進(jìn)行深入分析，檢測血管和纖維等結(jié)構(gòu)，依據(jù)病理分析結(jié)果對預(yù)后風(fēng)險等進(jìn)行分級：①H&E染色結(jié)果顯示腫瘤界限清晰且包膜完整的記為Ⅰ級，患者復(fù)發(fā)風(fēng)險?。虎贖&E染色結(jié)果顯示腫瘤界限不清晰無完整包膜的，Masson染色復(fù)檢顯示有腫瘤細(xì)胞侵潤或侵襲性生長的記為Ⅱ級，患者有復(fù)發(fā)風(fēng)險，應(yīng)定期進(jìn)行影像學(xué)檢查和接受隨訪；③H&E染色結(jié)果顯示腫瘤界限不清晰無完整包膜的，Masson染色復(fù)檢顯示有腫瘤細(xì)胞侵潤、侵襲性生長與腫瘤血管生成的記為Ⅲ級，患者有較高復(fù)發(fā)風(fēng)險，應(yīng)考慮輔助化療后定期影像學(xué)檢查和接受隨訪；④H&E染色結(jié)果顯示腫瘤界限不清晰無完整包膜的，Mas?son染色復(fù)檢顯示有腫瘤細(xì)胞侵潤、侵襲性生長與腫瘤血道轉(zhuǎn)移情況的記為Ⅳ級，患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險極高，應(yīng)考慮輔助化療后密切關(guān)注、定期影像學(xué)檢查和接受隨訪。

除TACE外，射頻消融（radiofrequencyablation，RFA）也是重要的介入治療策略，能夠較有選擇性地消融與殺傷腫瘤組織而非周圍組織[16]。RFA不僅有助于保護(hù)肝組織與正常肝臟功能，尤其適用于伴隨嚴(yán)重肝硬化的HCC患者[16]。與TACE治療類似，RFA治療也存在術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的問題[17-18]。本研究建立的方法，不僅有助于對TACE治療后患者HCC復(fù)發(fā)風(fēng)險進(jìn)行預(yù)測研究，也可用于RFA治療后患者HCC復(fù)發(fā)風(fēng)險預(yù)測研究。