孫衛(wèi)國(guó)，鄭本獻(xiàn)，熊志紅，楊秉芬，劉艷華，張靈霞

1.解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所，全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.軍事科學(xué)院 第61研究所門診部，北京 100141

血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth?factor，PDGF）是由細(xì)胞產(chǎn)生的肽類生長(zhǎng)因子，與受體結(jié)合后，通過Ras/GTP激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂[1]。PDGF參與機(jī)體組織的生長(zhǎng)發(fā)育、創(chuàng)傷愈合，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及動(dòng)脈粥樣硬化等[2]。在PDGF所有亞型中，PDGF-BB行使PDGF的主要功能，在創(chuàng)傷愈合的各個(gè)階段發(fā)揮重要作用[3]。PDGF-BB能加速成骨細(xì)胞內(nèi)的DNA合成與修復(fù)，刺激成骨細(xì)胞的復(fù)制和膠原降解，從而促進(jìn)骨折造成的創(chuàng)傷愈合[4]。目前利用原核表達(dá)系統(tǒng)規(guī)模化生產(chǎn)PDGF-BB細(xì)胞因子的主要困難是表達(dá)量非常低，復(fù)性率不高，純化條件不穩(wěn)定，生物活性也不高。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)原核表達(dá)特點(diǎn)，參照生物信息學(xué)和軟件Vector NTI suitor7.0分析結(jié)果，提高了PDGF-BB的表達(dá)量，占菌體總蛋白的25%[5]。在此，我們對(duì)基因工程下游技術(shù)進(jìn)行探索，對(duì)PDGF-BB包涵體的變性、復(fù)性方法和條件，以及純化工藝的優(yōu)化進(jìn)行多次嘗試，提高了PDGF-BB包涵體的復(fù)性率達(dá)40%以上，同時(shí)穩(wěn)定了重組蛋白的純化工藝，獲得了純度大于95%且具有良好生物活性的重組PDGF-BB蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

NIH3T3細(xì)胞株、宿主菌株大腸桿菌BL21（DE3）、表達(dá)載體pET-PGDF-BB由本室保存。酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid公司；PDGF-BB標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；PDGF-BB抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)羊抗兔IgG購(gòu)自Ab?cam公司；層析用填料SP SepharoseFF、分子篩填料Sephacryl S300購(gòu)自GE公司；FPLC蛋白純化分離系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 PGDF-BB重組蛋白的原核高表達(dá)

通過生物信息學(xué)分析，參照生物軟件對(duì)PGDF-BB編碼序列按照同義密碼子原則進(jìn)行置換優(yōu)化，設(shè)計(jì)合成了PDGF-BB全長(zhǎng)序列，3′端終止密碼為TAA，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-PGDFBB，工程菌接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600nm值達(dá)0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)7h，離心收集沉淀菌體，加入 50mmolTris-HCl（pH8.0）緩沖液，4℃條件下超聲波破碎，SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)量。

1.3 重組PGDF-BB蛋白包涵體洗滌溶解與初步純化

包涵體的初步洗滌對(duì)包涵體的復(fù)性極其重要，可將菌體的外膜蛋白、核酸、質(zhì)粒DNA等雜質(zhì)除去，避免影響隨后的復(fù)性過程。為了增加去垢劑洗滌能力，可在洗滌緩沖液（50mmol/LNaCl，50mmol/LTris，1mmol/LEDTA，0.5% Triton-X100+梯度尿素）內(nèi)加入一定濃度的鹽離子。洗滌后的包涵體用8mol/L尿素加2%巰基乙醇緩沖液充分溶解后，上樣分子篩層析柱Sephacryl S300，收集紫外檢測(cè)下各分離蛋白峰進(jìn)行SDSPAGE，分析初步純化后包涵體溶液的純度。

1.4 PGDF-BB包涵體復(fù)性與再純化

PDGF-BB成熟肽是由2個(gè)相同的單體蛋白PDGF-B通過二硫鍵形成的同型二聚體。相對(duì)單體蛋白而言，多聚體蛋白因?yàn)榉肿娱g與分子內(nèi)二硫鍵容易錯(cuò)配導(dǎo)致復(fù)性比較困難，針對(duì)不同蛋白需要摸索不同的復(fù)性方法。稀釋復(fù)性是將變性蛋白質(zhì)溶液直接加入復(fù)性緩沖液中，降低單位體積內(nèi)的變性蛋白濃度，減少錯(cuò)配幾率，適合多聚體蛋白的復(fù)性，因而是一種更簡(jiǎn)單和快速的方法。收集經(jīng)初步分子篩純化的包涵體上清液，以1∶100的比例和4mL/h的速度滴加稀釋到pH6.0的復(fù)性液（25mmol/LTris-Cl，0.1mmol/LNaCl，0.5mmol/L EDTA，4mol/L尿 素 ，0.1mmol/L GSSG，0.2mmol/LGSH，1%甘油）中，4℃放置24 h左右，取復(fù)性液按1∶10的比例置入pH6.0的透析 液（25mmol/L Tris-Cl，0.1mmolNaCl，0.5 mmol/LEDTA，2mol/L尿素，0.1mmol/LGSSG，0.2mmol/LGSH）中透析，10h換透析液一次，依次降低尿素濃度至1、0.5、0mol/L，高速離心除去沉淀。取上清液上樣SPSepharoseFF陽離子交換 柱 ，用 0.2 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-Cl（pH6.0）的緩沖液沖洗雜蛋白，用0.5mol/L NaCl、20mmol/LTris-Cl（pH7.4）的緩沖液洗脫目的蛋白；收集目的蛋白，SDS-PAGE分析經(jīng)復(fù)性純化后重組PGDF-BB蛋白的純度。

1.5 重組PDGF-BB蛋白的Western印跡鑒定與活性測(cè)定

取純化的PDGF-BB蛋白進(jìn)行14%的SDSPAGE，半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于37℃封閉1h，兔抗人PDGF-BB抗體于4℃孵育過夜，PBST緩沖液洗滌3次后，室溫條件下與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG結(jié)合2h，PBST緩沖液洗滌4次，每次5min，ECL暗室自動(dòng)曝光顯影驗(yàn)證重組蛋白的抗原性。

將培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期NIH3T3細(xì)胞以含10%小牛血清的DMEM調(diào)成細(xì)胞懸液，按1×104/孔傳入96孔板，37℃孵箱中培養(yǎng)48h，更換成含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，依次加入用維持培養(yǎng)液稀釋的重組蛋白和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品PDGF-BB，每濃度梯度做3個(gè)平行孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72h，MTT法檢測(cè)各孔的D490nm值，繪制對(duì)應(yīng)的D490nm值與PDGF-BB濃度曲線。

2 結(jié)果

2.1 PGDF-BB重組蛋白的原核高表達(dá)

參照生物信息學(xué)和生物軟件分析，合成PGDF-BB編碼序列，克隆構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-PGDF-BB，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)7h，收集菌體超聲波破碎，SDS-PAGE分析結(jié)果，圖1箭頭示重組蛋白，編碼核酸經(jīng)過優(yōu)化后，重組蛋白表達(dá)水平明顯提高，表達(dá)量從優(yōu)化前的10%（4泳道）上升到25%左右（1、2泳道）。超聲波破碎后，重組蛋白以包涵體的形式存在于菌體沉淀中。

2.2 PGDF-BB包涵體洗滌溶解與分子篩層析純化

包涵體用 50mmol/LNaCl、50mmol/LTris、1mmol/LEDTA、0.5%Triton-X100洗滌2次，離心收集上清進(jìn)行電泳分析，洗滌后的包涵體分別用2、4、8mol/L尿素加2%巰基乙醇緩沖液充分溶解，離心收集上清進(jìn)行包涵體溶解度檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，經(jīng)過3次0.5%Triton-X100洗滌后，上清中沒有目的蛋白出現(xiàn)，大多數(shù)雜蛋白被除去，包涵體得到富集。梯度尿素溶解后發(fā)現(xiàn)包涵體只能溶解在8mol/L尿素中，這為后續(xù)大規(guī)模純化帶來方便。

圖1 PGDF-BB優(yōu)化序列誘導(dǎo)后的全菌體蛋白SDS-PAGE分析

包涵體用8mol/L尿素加2%巰基乙醇充分溶解，高速離心收集上清上樣過分子篩層析柱Sep?hacrylS300，F(xiàn)PLC檢測(cè)各分離蛋白峰，SDS-PAGE分析經(jīng)初步純化后包涵體溶液的純度，結(jié)果見圖3、4，包涵體溶液得到部分富集。

2.3 PGDF-BB包涵體復(fù)性與離子交換層析

分別采用透析、稀釋和滴加復(fù)性的方法對(duì)PGDF-BB包涵體復(fù)性，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)滴加復(fù)性相對(duì)其他方法而言可以獲得更高的復(fù)性率。滴加復(fù)性的方法更適合含有較多分子間或分子內(nèi)二硫鍵的多聚體蛋白，滴加樣品的速度和復(fù)性液的組成都會(huì)影響最終的復(fù)性率。為了便于后續(xù)陽離子交換層析，將復(fù)性液的pH值設(shè)置為6.0左右，復(fù)性液的組成為25mmol/LTris-Cl、0.1 mmol/LNaCl、0.5mmol/LEDTA、4mol/L 尿 素（pH6.0）、0.1mmol/LGSSG、0.2mmol/LGSH，1%甘油。滴加復(fù)性后PDGF-BB的復(fù)性率在40%以上，復(fù)性后溶液高速離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖5。

圖2 PDGF-BB包涵體洗滌、尿素溶解的SDS-PAGE分析

圖3 PDGF-BB包涵體溶液SephacrylS300層析液的UV檢測(cè)

圖4 PDGF-BB包涵體溶液SephacrylS300層析液的SDS-PAGE 1：上樣前；M：蛋白marker；2：出峰前收集液；

參照PDGF-BB的理化特性，采用陽離子交換層析對(duì)復(fù)性后的溶液進(jìn)行二次純化，用0.2mol/LNaCl洗去雜蛋白，0.5mol/LNaCl、20mmol/L Tris-Cl（pH7.4）緩沖液洗脫目的蛋白峰，收集目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，分析純化后重組PGDF-BB蛋白的純度。結(jié)果如圖6、7，經(jīng)分子篩和離子交換層析后，重組蛋白的純度可達(dá)95%以上。

2.4 重組PDGF-BB蛋白的Western印跡與活性測(cè)定結(jié)果

圖5 PDGF-BB包涵體復(fù)性后的SDS-PAGE

圖6 PDGF-BB包涵體復(fù)性液SPSepharoseFF層析UV檢測(cè)

以PDGF-BB標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對(duì)照、PBS為陰性對(duì)照，純化的PDGF-BB蛋白分別與兔抗人PDGFBB一抗和羊抗兔IgG-HRP二抗進(jìn)行孵育、洗滌和暗室曝光，Western印跡結(jié)果表明純化的重組蛋白能與hPDGF-BB抗體結(jié)合，具有強(qiáng)的抗原性。

MTT方法驗(yàn)證重組蛋白的生物活性，以PDGF-BB標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對(duì)照，制作D490nm值與PDGF-BB濃度曲線，發(fā)現(xiàn)獲得的重組蛋白具有良好的生物活性，對(duì)NIH3T3細(xì)胞具有明顯的促增殖作用，與標(biāo)準(zhǔn)品表現(xiàn)出一致性，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上無差異。

3 討論

PDGF-BB具有多種生物學(xué)功能，含0.01%重組人PDGF-BB的羧甲基纖維素鈉膠（NaCMC）已在美國(guó)獲準(zhǔn)用于遠(yuǎn)端神經(jīng)性糖尿病潰瘍的治療。在PDGF所有亞型中，PDGF-BB的功能如促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、骨組織修復(fù)和重建作用已得到肯定。目前利用原核系統(tǒng)生產(chǎn)重組人PDGF-BB蛋白受制于表達(dá)量低、復(fù)性困難而無法大規(guī)模生產(chǎn)。本研究參照生物軟件分析，從生物信息學(xué)角度對(duì)其mRNA序列進(jìn)行同義密碼子置換，獲得了PDGF-BB在原核系統(tǒng)內(nèi)的高表達(dá)，明顯優(yōu)于優(yōu)化前的水平。同時(shí)，對(duì)PDGF-BB包涵體洗滌、溶解與復(fù)性嘗試了不同條件，大大提高了包涵體的復(fù)性效率可達(dá)40%。依據(jù)蛋白的理化特性，經(jīng)過不同純化方法的結(jié)合，最終獲得具有良好生物活性和高純度的重組蛋白。本實(shí)驗(yàn)建立了高表達(dá)、易純化的工藝，為大規(guī)模制備原核重組人PDGF-BB蛋白奠定了基礎(chǔ)。

圖7 PDGF-BB復(fù)性液SPSepharoseFF純化的SDS-PAGE M：蛋白marker；1：SP純化后的PDGF-BB重組蛋白

圖8 重組PGDF-BB的Western印跡

圖9 重組PDGF-BB對(duì)NIH3T3細(xì)胞的促增殖作用