汪楚翔，劉涵，張函槊

1.北京市第十五中學(xué) 高二七班，北京 100054;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院 腫瘤科，北京100038；3.北京基石生命科技有限公司，北京 100195

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，約22個(gè)核苷酸，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)（完全配對(duì)或不完全配對(duì)）靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR），直接降解mRNA或抑制翻譯，從而完成對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。，miRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)22.0（miRBase）目前收集到發(fā)夾前體序列38589條，成熟miRNA和miRNA*產(chǎn)物共48885條，形成了巨大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA與許多生理病理過(guò)程密切相關(guān)，如生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、脂類代謝、激素分泌、腫瘤形成和病毒感染等。

miR-195序列首先發(fā)現(xiàn)于鼠基因，后經(jīng)同源序列預(yù)測(cè)在人類基因中得以驗(yàn)證。hsa-miR-195位于染色體17pl3.1區(qū)，由7017615～7017701的堿基對(duì)構(gòu)成。miR-195是miR-15/16/195/424/497家族的重要成員，在多種疾病如癌癥、心力衰竭和精神分裂癥中發(fā)揮重要作用[1-2]。近年的靶標(biāo)預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)研究表明，miR-195可通過(guò)CCND3、FLT3、WEE1[3]、E2F2[4]、Bcl-2、BNDF[5]、Arl2[6]等靶點(diǎn)發(fā)揮作用。研究表明，miR-195具有抑制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的普遍作用，所以miR-195容易被簡(jiǎn)單地概括為一種抑癌因子，但事實(shí)可能并非如此。我們采用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法，比較了miR-195在結(jié)直腸癌和肺癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)差異，并初步探討了miR-195在人結(jié)直腸癌和肺癌細(xì)胞中的功能差異。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、小鼠肺癌細(xì)胞系344SQ、小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞系MC38（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心）；RMPI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipo?fectAMINE2000（Invitrogen公司）；miR-195-5p模擬物（廣州銳博公司）；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠（康寧公司）；CCK-8試劑盒（上海碧云天公司）；All-in-OnemiRNAqRT-PCR檢測(cè)試劑盒（GeneCopoeia,公司）。

1.2 miRNA腫瘤組織表達(dá)分析

利用starBase泛癌分析平臺(tái)（http://starbase.sy?su.edu.cn/panCancer.php）挖掘來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）的不同癌癥類型的miRNA表達(dá)譜。

1.3 細(xì)胞總RNA提取

細(xì)胞用1×PBS緩沖液漂洗2次，每孔加入1 mLTRIzol試劑，室溫裂解至細(xì)胞裂解物清亮；加入200μL氯仿，劇烈振蕩10s，室溫靜置5min；4℃、12000r/min離心15min；小心吸取上層水相移至新管，加等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置30min；4℃，12000r/min離心15min后見(jiàn)管底白色沉淀即為總RNA；吸棄上清，加入1 mL80%乙醇顛倒混勻；4℃、10000r/min離心15min；棄上清后室溫晾干，用DEPC水溶解沉淀；取適量RNA樣品，稀釋后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，讀取D260nm/D280nm比值測(cè)定純度，電泳鑒定RNA的完整性。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

用All-in-OnemiRNAqRT-PCR檢測(cè)試劑盒分析miRNA相對(duì)含量。按照說(shuō)明書(shū)步驟，用通用反轉(zhuǎn)錄引物（5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC TCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′）將 2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄條件：反應(yīng)總體積25 μL，37℃反應(yīng) 60min，結(jié)束后再進(jìn)行85℃、5min滅活處理），所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌水稀釋至1/20，采用特異上游引物（5′-CGCAGTAGCAGCAC AGA-3′）和通用下游引物（5′-GCGAGCACAGAA TTAATACGAC-3′）進(jìn)行下游qPCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體積20 μL（PCR條件：95℃預(yù)變性 10min；95℃變性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s，40個(gè)循環(huán)），U6作為內(nèi)參（U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCA GCACA-3′），通過(guò) CT（2-ΔΔCt）方法分析 miRNA 相對(duì)含量。各組PCR均進(jìn)行3孔重復(fù)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞按2×105/mL的密度種于24孔板中，用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；用LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞；每孔取0.5μL轉(zhuǎn)染試劑和miRNA模擬物20pmol，分別稀釋于250μL無(wú)血清1640培養(yǎng)基中，輕彈混勻，室溫靜置5min；將稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑加入miRNA稀釋物中，輕彈混勻，室溫靜置20min；將miRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)4h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取總RNA用于miRNA定量檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以2×103/孔種于96孔板，37℃培養(yǎng) 24、48、72和96h后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，即每孔加入10μLCCK-8，4h后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的D450nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D450nm值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以5×105/孔接種于6孔板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。繼續(xù)培養(yǎng)24h，消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，稀釋至2×105/mL，每種細(xì)胞種3個(gè)小室，每個(gè)小室中加入200μL細(xì)胞，在24孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為下液，將Tran?swell小室放入孔中，繼續(xù)培養(yǎng)12～24h取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)表面未穿膜的細(xì)胞，甲醇固定15min，DAPI染核 10min，用PBS洗3次，于熒光顯微鏡下觀察，20×10視野下計(jì)數(shù)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將凍存于-80℃冰箱的Matrigel基質(zhì)膠于4℃過(guò)夜（24h），變成液態(tài)。取300μL無(wú)血清培養(yǎng)基，加入 60 μL（或 50 μg/室）Matrigel，4℃混勻，加入Transwell小室各100 μL（3個(gè)室），放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4～5h，當(dāng)出現(xiàn)白色層時(shí)說(shuō)明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用x±s表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)分析和方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-195-5p在肺癌和結(jié)腸癌組織中的表達(dá)差異

通過(guò)starBasev2.0中的Pan-CancerPlatform直接調(diào)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)miR-195-5p的miRNA-seq數(shù)據(jù)，并進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)中包括440例肺腺癌、332例肺鱗癌和314例結(jié)直腸癌樣本，均以相對(duì)應(yīng)的正常組織為對(duì)照。結(jié)果（圖1）顯示，miR-195-5p在肺腺癌和肺鱗癌中的表達(dá)含量都低于正常組織，然而在結(jié)直腸癌中的相對(duì)含量卻高于正常對(duì)照。

圖1 通過(guò)starBase分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-195-5p在肺癌與結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)差異

2.2 miR-195-5p在肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)差異

進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了miR-195-5p在肺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)含量。實(shí)驗(yàn)采用了4種細(xì)胞，即人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、人肺癌細(xì)胞A549、小鼠肺癌細(xì)胞344SQ和小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞MC38。結(jié)果顯示，無(wú)論在人還是小鼠的肺癌細(xì)胞中，miR-195-5p的相對(duì)含量均顯著低于對(duì)應(yīng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞（圖2）。miR-195-5p在肺癌和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)差異揭示了miR-195-5p在不同腫瘤中可能具有不同的甚至相反的生物學(xué)功能。

2.3 miR-195-5p對(duì)肺癌與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖調(diào)控

為了探討miR-195-5p在肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中潛在的功能差異，我們首先檢測(cè)了miR-195-5p對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的增殖影響。CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，miR-195-5p模擬物轉(zhuǎn)染A549及SW620細(xì)胞，與轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)對(duì)照miRNA（NCmiRNA）模擬物組相比，在72h后細(xì)胞增殖都發(fā)生明顯改變。有趣的是，miR-195-5p過(guò)表達(dá)后對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了完全相反的效應(yīng)，表現(xiàn)出抑制肺癌細(xì)胞但卻促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖（圖3）。

2.4 miR-195-5p對(duì)肺癌與結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲與遷移的調(diào)控

利用Transwell檢測(cè)了miR-195-5p對(duì)肺癌與結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響。結(jié)果與增殖調(diào)控類似，miR-195-5p在2種腫瘤細(xì)胞中調(diào)控遷移與侵襲的能力迥異。與細(xì)胞遷移結(jié)果一致，miR-195-5p的過(guò)表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞A549的侵襲與遷移（圖4A），反過(guò)來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的侵襲與遷移（圖4B）。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-195-5p在人肺癌細(xì)胞A549和人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620中的相對(duì)表達(dá)含量（**P＜0.01）

3 討論

隨著對(duì)miRNA研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明，在不同組織、器官、細(xì)胞類型和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，miRNA的表達(dá)譜有很大差異，揭示miRNA的表達(dá)具有時(shí)序特異性和組織特異性。每種miRNA針對(duì)的數(shù)個(gè)甚至上百個(gè)潛在靶基因，在不同的細(xì)胞或同一細(xì)胞的不同狀態(tài)下發(fā)揮功能性靶標(biāo)的作用也有所不同[7]。這些研究結(jié)果不但說(shuō)明miRNA及其靶標(biāo)具有時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的特性，而且也提示miRNA在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用的復(fù)雜性。

圖3 CCK-8法檢測(cè)miR-195-5p對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620和人肺癌細(xì)胞A549增殖的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 Transwell法檢測(cè)miR-195-5p對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620和人肺癌細(xì)胞A549遷移與侵襲的影響

本研究通過(guò)starBase調(diào)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了miR-195-5p在結(jié)直腸癌（314例）和肺癌（646例）中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-195-5p在結(jié)直腸癌中相對(duì)于正常組織是高表達(dá)的，而在肺癌中截然相反。隨后，我們通過(guò)結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞證實(shí)了miR-195-5p在表達(dá)上，以及細(xì)胞增殖、侵襲與遷移功能上的差異，揭示了miR-195-5p調(diào)控功能的復(fù)雜性。

同時(shí)有研究表明，miR-195-5p在其他腫瘤中的表達(dá)有高有低，在舌鱗狀細(xì)胞癌[8]、膀胱腫瘤[9]、原發(fā)性腹膜癌[10]、乳腺癌[11]、胃癌和肝細(xì)胞癌[12]中均表達(dá)下調(diào)，在替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)細(xì)胞瘤[13]、腎上腺皮質(zhì)癌[14]、慢性淋巴細(xì)胞白血病[15]中表達(dá)上調(diào)。因此，miR-195在不同類型的腫瘤中表達(dá)不同，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，不能簡(jiǎn)單地概括為一種抑癌因子或促癌因子，miR-195在腫瘤中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)