蔣瑞東，高 鑫，李云章

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

炎癥反應(yīng)是機體由各種炎癥因子或外界有害刺激和損傷所引起的防御反應(yīng)，是滅活和消除這些炎癥因子，為組織修復(fù)創(chuàng)傷環(huán)境的一個非常普遍而重要的基本病理過程［1］。局部組織的惡化、滲出和增生的變化是炎癥反應(yīng)的主要表現(xiàn)［2］。它伴隨著許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，同時也會促進(jìn)疾病的發(fā)展。ZD制劑［3］是治療馬屬動物肢蹄軟組織損傷的經(jīng)典處方，臨床使用效果良好。該方由川椒、茵陳、白芨等12味中草藥組成。前期試驗表明ZD制劑對IL-1β、IL-6有良好的抑制作用［4］，但ZD制劑對腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）的具體作用尚不明確。

該試驗通過脂多糖（LPS）刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系建立細(xì)胞炎癥模型，并檢測ZD制劑干預(yù)前后TNF-α濃度的變化；通過TNF-α刺激小鼠成纖維細(xì)胞L929建立細(xì)胞毒性模型，并檢測ZD制劑干預(yù)前后細(xì)胞活力的變化，對其在炎癥中對TNF-α的作用進(jìn)行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)液、RPM1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白 酶 （Biologic）， 胎 牛 血 清 （Gibco），LPS、MTT、DMSO（Sigma），TNF-α［愛必信（上海）生物科技有限公司］，小鼠TNF-α ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系、小鼠成纖維細(xì)胞L929購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。12味中草藥均購自內(nèi)蒙古國大藥房。

1.2 ZD制劑的制備

12味中藥按藥方混合，粉碎成粗粉，冷水浸泡過夜，加蒸餾水浸沒藥材，通過中醫(yī)煎藥機采用包煎法進(jìn)行煎煮，文火加熱，逐漸加大火力煮沸，保持微沸狀態(tài)計時，持續(xù)煮沸40 min，重復(fù)3次。湯劑煎完后進(jìn)行榨渣取汁，收集壓榨得到的藥液并過濾，將過濾液與煎液合并，冷卻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對藥液進(jìn)行濃縮。最后濃縮成1 g/mL生藥的中藥提取原藥藥液，消毒除菌備用。然后用培養(yǎng)液將ZD 制劑稀釋成 5 種濃度，即 100、10、1、0.1、0.01 μg/mL用于后續(xù)試驗。

1.3 細(xì)胞分組

1.3.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7分組：將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7按1×107cell/mL濃度接種于12孔板中。37℃、5%CO2條件下貼壁培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用D-Hanks生理緩沖液沖洗3次，洗棄未貼壁細(xì)胞，在每孔加入含有5%NCS的DMEM培養(yǎng)基后按以下分組進(jìn)行處理：正常組，不加LPS和ZD制劑；LPS組，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入LPS溶液，使其終濃度為1 μg/mL，但不加入ZD制劑藥液；試驗組，分為5組（分別為 ZD 1 組、ZD 2 組、ZD 3 組、ZD 4 組、ZD 5組），先添加ZD制劑，使ZD制劑終濃度分別為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL，在藥物作用 1 h 后添加LPS，使LPS終濃度為1 μg/mL。每組重復(fù)5個復(fù)孔，將上述接種于12孔板的細(xì)胞與不同濃度藥物或溶劑在37℃、5%CO2條件下孵育1 h。

1.3.2 小鼠成纖維細(xì)胞L929分組：具體操作同1.3.1。組別分為：正常組，不加TNF-α和ZD制劑；TNF-α組，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TNF-α溶液，使其終濃度為4 ng/mL，但不加入ZD制劑；試驗組，分為5組（分別為ZD 1組、ZD 2組、ZD 3組、ZD 4組、ZD 5組），添加ZD制劑，使ZD制劑終濃度分別為 100、10、1、0.1、0.01 μg/mL， 在藥物作用 1 h后添加TNF-α，使TNF-α終濃度為4 ng/mL。培養(yǎng)液采用含5%NCS的RPM1640培養(yǎng)液。

1.4 細(xì)胞毒性的檢測

采用MTT法分別檢測RAW264.7細(xì)胞和L929細(xì)胞在490 nm處吸光光度值。

1.5 TNF-α含量的測定

在使用LPS干預(yù)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7 24 h后收集上清液。用TNF-α放免試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量，具體實驗操作步驟按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 ZD制劑對TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞的生長抑制作用

操作方法同1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZD制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7毒性的影響

采用MTT法檢測細(xì)胞活性，濃度為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL 的 ZD 制劑處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7后，與正常組和LPS組相比，細(xì)胞活力沒有顯著差異（見圖1），說明ZD制劑在該試驗條件下不會出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性反應(yīng)。

圖1 ZD制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7的毒性分析

2.2 ZD制劑對小鼠成纖維細(xì)胞L929毒性的影響

采用的MTT法檢測細(xì)胞活性，濃度為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL 的 ZD 制劑處理的小鼠成纖維細(xì)胞L929后，與正常組相比，細(xì)胞活力沒有顯著差異（見圖2），說明ZD制劑在該試驗條件下無明顯的細(xì)胞毒性反應(yīng)。

圖2 ZD制劑對小鼠成纖維細(xì)胞L929的毒性分析

2.3 ZD制劑對TNF-α水平的影響

由表1可以看出，由ZD制劑干預(yù)后的巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α水平與LPS模型組相比降低明顯，且有明顯劑量依賴性。ZD制劑濃度為100、10、1、0.1 μg/mL 時，TNF-α 濃度與 LPS 模型組相比，差異極顯著 （P＜0.01），ZD 制劑濃度為 0.01 μg/mL時，TNF-α濃度與LPS模型組相比，差異顯著（P＜0.05）。

表1 不同試驗組上清液中TNF-α的水平

2.4 ZD制劑對TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞死亡的影響

表2 ZD制劑抑制TNF-α對L929細(xì)胞的毒性分析

采用MTT法檢測細(xì)胞活性，由表2可以看出，由ZD制劑干預(yù)后的小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞活力與TNF-α組相比顯著提高，且有明顯劑量依賴性。說明ZD制劑在該試驗條件下可以抑制TNF-α誘導(dǎo)L929成纖維細(xì)胞的死亡。

3 討論

巨噬細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)劑等，它們在機體的先天性免疫系統(tǒng)中起著重要的作用［5］。在炎性反應(yīng)進(jìn)程中，巨噬細(xì)胞通過分泌不同種類的細(xì)胞炎癥介質(zhì)直接或間接地參加到各種炎癥疾病反應(yīng)進(jìn)程［6-7］。 近年來多運用脂多糖（LPS）刺激動物來構(gòu)建用于評估藥物、食品、營養(yǎng)的全身炎癥模型［8］。LPS參與構(gòu)成革蘭陰性菌的細(xì)胞壁，是內(nèi)毒素的主要成分，當(dāng)LPS或其他病原微生物進(jìn)入巨噬細(xì)胞時其會表達(dá)不同類型的促炎癥因子，如表達(dá) TNF-α、IL-6 等來誘導(dǎo)和加強局部炎癥反應(yīng)［9］。TNF-α是一種重要的炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫等多種生理和病理過程，它有很多生物學(xué)活性［10］。它既可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素類炎癥因子的表達(dá)，也可以誘導(dǎo)干擾素類等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)［11］。所以該試驗通過使用LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌TNF-α體外模型應(yīng)用于試驗研究，該模型可以較好地用于非特異性抗炎藥物的篩選以及抗炎藥物作用機制的研究［12］。

腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一個含有157個氨基酸的非糖基化蛋白，是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、炎癥、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用，也是重要的促炎細(xì)胞因子和抗腫瘤因子［13］。TNF-α是參與炎癥反應(yīng)的“一線”細(xì)胞因子，炎癥發(fā)生時其含量最快升高且起核心作用，并能刺激IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的釋放，起到所謂瀑布效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致全面的炎癥反應(yīng)［14］。

因此，該試驗通過ELISA法檢測在使用不同濃度的ZD制劑干預(yù)后，經(jīng)過LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7導(dǎo)致TNF-α的含量變化。結(jié)果表明，LPS刺激細(xì)胞24 h后，細(xì)胞因子TNF-α含量極顯著高于正常細(xì)胞，表明體外炎癥模型已成功構(gòu)建。給予不同濃度的ZD制劑后，在100 μg/mL和10 μg/mL的濃度下，ZD制劑可以顯著減少TNF-α的分泌量，從而起到抗炎作用。

TNF-α對某些腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是它最主要的生物學(xué)活性之一。根據(jù)這一特點，可以測定TNF-α敏感靶細(xì)胞的活性，并根據(jù)細(xì)胞死亡情況獲得TNF-α的相對活性。在眾多細(xì)胞株中，只有小鼠成纖維細(xì)胞L929對TNF-α的敏感性最強，所以，至今在TNF-α的研究過程中，很多學(xué)者還一直選用小鼠成纖維細(xì)胞L929作為TNF-α的活力測定對象［15］。因此，該試驗選取小鼠成纖維細(xì)胞L929作為TNF-α的活力測定對象，通過MTT法測定TNF-α對小鼠成纖維細(xì)胞L929的毒性作用，結(jié)果顯示，在TNF-α濃度為4 ng/mL時，小鼠成纖維細(xì)胞L929活力明顯下降，細(xì)胞生長抑制率為42.9%，與正常組有顯著差異，說明成功構(gòu)建了TNF-α對小鼠成纖維細(xì)胞L929的毒性試驗?zāi)Ｐ汀＝o予不同濃度的ZD制劑后，在100 μg/mL及10 μg/mL濃度下，ZD制劑可以顯著抑制TNF-α的生物學(xué)活性，細(xì)胞活力與TNF-α模型組差異顯著，細(xì)胞生長抑制率為19.6%，說明ZD制劑可以通過降低毒性模型中TNF-α的生物學(xué)活性來提高小鼠成纖維細(xì)胞L929的存活率。在炎癥反應(yīng)中，TNF-α是一種重要的促炎癥因子，TNF-α含量及活性的提升會促進(jìn)炎癥的發(fā)展。該試驗結(jié)果提示ZD制劑在炎癥反應(yīng)過程中也能通過抑制TNF-α的活性來達(dá)到抗炎的目的。

綜上所述，ZD制劑在炎癥反應(yīng)發(fā)生時可以顯著降低促炎癥因子TNF-α的含量，在炎癥反應(yīng)發(fā)生后可以顯著降低TNF-α活性，從而在兩方面抑制炎癥反應(yīng)，達(dá)到抗炎效果。傳統(tǒng)消炎藥物還可以通過抑制COX-2等因子來達(dá)到抗炎的作用，由于該試驗只檢測了單一的因子，ZD制劑對COX-2等相關(guān)因子的作用有待進(jìn)一步的試驗研究。

［1］倪志宇.CCK-8對炎癥反應(yīng)中促炎及抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控機制研究 ［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2005：168-196.

［2］程瑤，郭澤，王平，等.蒲公英甾醇對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS和COX-2表達(dá)的影響及其機制研究［J］.免疫學(xué)雜志，2015，31（10）：860-863.

［3］柏合.自制外用中藥軟膏對實驗小鼠急性軟組織損傷的初步研究 ［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［4］高鑫.ZD制劑對小鼠軟組織損傷修復(fù)及對RAW264.7炎癥因子的影響［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［5］ZHANG S S，NIE S P，XIE M Y，et al.Effect of polysaccharide of Ganpderma atrum on the function of mouse peritoneal macrophages in vitro ［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（9）：1139-1142.

［6］王彩云，邰春格，劉明強.?；悄懰釋π∈竺庖吖δ艿恼{(diào)節(jié) ［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版），2011，32（4）：19-24.

［7］王建楠，阮洪生，崔玉東，等.身痛逐瘀湯通過調(diào)控P38MAPK信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮的分泌［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2015，27（3）：75-78.

［8］OBERBECK R，SCHMITZ D，WILSENACK K，et al.Prolactin modulates survival and cellular immune functions in septic mice ［J］.Journal of Surgical Research，2003，113（2）：248-256.

［9］陳秋玲，高幼衡，張麗媛.Nodosin對脂多糖刺激RAW264.7細(xì)胞分泌NO及細(xì)胞因子的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，30（22）：211-213.

［10］丘創(chuàng)華，侯敢，黃迪南．TNF－α信號傳導(dǎo)通路的分子機理 ［J］．中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2007，23（6）：430-435．

［11］伏爽，錢玉昆.腫瘤壞死因子的研究進(jìn)展［J］．國際免疫學(xué)雜志，1993（5）：252-257.

［12］畢文巖．人參皂苷Rh2衍生物的體外抗炎作用及分子機制研究［D］．長春：吉林大學(xué)，2009．

［13］周林，楊慧，艾有生，等.中藥單體抗TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機制研究進(jìn)展 ［J］.南昌大學(xué)學(xué)報 （醫(yī)學(xué)版），2013，53（3）：72-75.

［14］王娜娜， 劉慶民.TNFα、IL-6、NF-κB 及其抑制劑與急性胰腺炎研究進(jìn)展 ［J］.中國消化病與影像雜志（電子版），2015，5（5）：253-255.

［15］葉元超.腫瘤壞死因子TNFα及冬凌草甲素誘導(dǎo)小鼠成纖維肉瘤L929細(xì)胞死亡的機制研究［D］.沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2012.