劉巧，胡慧玲，岳青，方明，王戰(zhàn)國(guó)

圖1 糖尿?。ㄏ剩┑闹嗅t(yī)治療模式圖 [10]

三黃瀉心湯始載于張仲景的《金匱要略》，由大黃、黃連、黃芩三味中藥組成[1]，在治療中醫(yī)消渴證（糖尿?。┑呐R床應(yīng)用中療效明確，同時(shí)以其為基礎(chǔ)衍生的類方也廣泛用于消渴證（糖尿?。┑呐R床治療[2～3]。中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)2007年發(fā)布的《糖尿病中醫(yī)防治指南》總結(jié)出糖尿?。ㄏ首C）的中醫(yī)治療模式圖中，瀉心湯及類方具有重要貢獻(xiàn)[4]（見圖1）。研究證實(shí)三黃瀉心湯及所含中藥大黃、黃連、黃芩中化學(xué)成分均具有明確的抗 Ⅱ 型糖尿病的生物活性[5～9]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示糖尿病發(fā)病率日益提高，中國(guó)已成為世界糖尿病第一大國(guó)，成年人口發(fā)病率達(dá)11.6 %，糖尿病前期患者更是高達(dá)50.1%[11]。因此，本課題以三黃瀉心湯為研究對(duì)象，初步開展其對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠的降血糖研究，以對(duì)后期的機(jī)制研究和臨床用藥進(jìn)行指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí) SD 雄性大鼠 40 只，體重 90±10 g，購(gòu)買自成都達(dá)碩生物科技有限公司，科技部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)： SCXK（川） 2011-20。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HEM-112 歐姆龍血糖儀（歐姆龍自動(dòng)化（中國(guó)）有限公司）；二型糖尿病大鼠造模實(shí)驗(yàn)21BS-101 血糖試紙（歐姆龍自動(dòng)化（中國(guó)）有限公司）；CX2000 動(dòng)物秤（500 g ± 0.01 g）（CHANGXIE/長(zhǎng)協(xié)電子有限公司）；YB-ZBJ-X40制冰機(jī)（上海億倍實(shí)業(yè)有限公司）；FA1004B 電子分析天平（上海平軒科學(xué)儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.3 試劑耗材

葡萄糖（成都市科龍化工試劑廠）；高脂高糖飼料[維持飼料65%，豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鈉1%，混調(diào)劑（雞蛋麻油花生）1.5%（北京博愛港商貿(mào)有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ）（北京博愛港商貿(mào)有限公司，批號(hào)：170226，純度≥98.5 %）；檸檬酸和檸檬酸鈉（北京博愛港商貿(mào)有限公司）；大黃藥材（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：161010），黃連藥材（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：170330），黃芩藥材（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：160827），經(jīng)鑒定，藥材各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015 版規(guī)定項(xiàng)下要求；鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥公司，批號(hào)：AA07507，規(guī)格：0.85 g/片）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 三黃瀉心湯合煎液的制備 取大黃粉末120 g、黃連粉末60 g、黃芩粉末60 g（均過四號(hào)篩），精密稱定，以上三味，加入10倍量純水浸泡30 min后煎煮三次，第一次1.5 h，第二次1 h，第三次40 min，合并煎液，趁熱濾過，得煎煮液約800 mL。然后將400 mL煎煮液濃縮至200 mL后冷凍干燥得粉末54 g，計(jì)算粉末得率為22.5 %。臨用前用生理鹽水配置成濃度為56.25 mg粉末/mL的灌胃溶液（臨床劑量換算為1.5 g生藥/kg，每只給藥體積為2 mL），置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 鹽酸二甲雙胍溶液的制備 取鹽酸二甲雙胍片10片，加入243 mL 純水稀釋成35 mg·mL-1的灌胃溶液（臨床劑量換算為210 mg·kg-1，每只給藥體積為2 mL），置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 緩沖液的制備 取檸檬酸(FW:210.14) 2.1 g ，精密稱定，加入雙蒸水 100 mL 中配成 A 液；取檸檬酸鈉(FW:294.10) 2.94 g，精密稱定， 加入雙蒸水 100 mL 中配成 B 液；用時(shí)將 A、B 液按一定比例混合（1：1.32），pH 計(jì)測(cè)定 pH 值,調(diào)節(jié) pH =4.2～4.5，即是所需配置 STZ 的檸檬酸緩沖液。制備完成后抽濾，置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 40%葡萄糖溶液的制備 取葡萄糖40 g ，精密稱定，加入生理鹽水100 mL 配制成40 %葡萄糖，置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)方法 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)一周，給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期（14 h 光照、10 h 黑夜），實(shí)驗(yàn)室溫度維持在20～25 ℃，相對(duì)濕度控制在70 %左右。將大鼠隨機(jī)分為 4 組，每組 10 只，對(duì)其中3 組大鼠喂食高脂高糖飼料，另一組喂食普通飼料，不限制進(jìn)食量，自由飲水。每周對(duì)大鼠進(jìn)行進(jìn)食量、飲水量和體重等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的測(cè)定。

2.2.2 STZ造模 對(duì)大鼠喂食高脂高糖飼料 1～2 月，誘導(dǎo)其產(chǎn)生胰島素抵抗，然后進(jìn)行 STZ 注射。SD 大鼠隔夜禁食 12 h，不禁水，精密稱取大鼠體重，按照50 mg·kg-1給藥劑量設(shè)計(jì)藥物濃度及給藥體積。稱取 STZ 溶于配好的檸檬酸緩沖液中，渦旋至充分溶解，置于冰浴中，在 20 min 內(nèi)快速完成大鼠腹腔注射。在造模后 2 h 可以正常喂食。

2.2.3 Ⅱ型糖尿病大鼠模型驗(yàn)證 造模一月內(nèi)，每周大鼠白天禁食 6 h，取尾部血液少許，使用歐姆龍血糖測(cè)試儀及歐姆龍血糖試紙進(jìn)行血糖檢測(cè)，檢測(cè)大鼠空腹血糖（FBG），采用 FBG≥16.7 mmoL·L-1為判定標(biāo)準(zhǔn)，若大鼠血糖值高于標(biāo)準(zhǔn)，則初步判定糖尿病大鼠高血糖模型造模成功。

葡萄糖耐受試驗(yàn)（OGTT）：實(shí)驗(yàn)大鼠隔夜禁食12 h 以上，腹腔注射 2 g·kg-1的 40%的葡萄糖溶液，在 0、30、 60 、90 和 120 min 的時(shí)候采集尾靜脈血，測(cè)量并記錄其血糖值，然后計(jì)算相應(yīng)的曲線下面積（AUC）。

2.2.4 給藥方法和分組 將模型成功的糖尿病大鼠24 只，隨機(jī)分為三黃瀉心湯組（XXD）、二甲雙胍陽性藥組（MH）、模型組（DM）3 組，“2.3.1”項(xiàng)下喂食普通飼料的大鼠設(shè)為正常組（NC），每組8只。每組分別給予相應(yīng)藥物 2 mL/只/d，正常組和模型組給予等量的生理鹽水。于給藥后每周測(cè)量大鼠體重，飲水量，進(jìn)食量等，于給藥每?jī)芍軠y(cè)量大鼠空腹血糖（FBG），于給藥每四周測(cè)定大鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以( ±s)表示，組間比較用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 Ⅱ型糖尿病大鼠模型驗(yàn)證

造模一月后，與正常大鼠相比，造模后的大鼠體重增幅較小，甚至有所下降，血糖值均高于FBG≥16.7 mmol·L-1，尿量明顯增加，飲水量和進(jìn)食量明顯高于正常組。此結(jié)果符合糖尿病大鼠“三多一少”的特點(diǎn)，初步判定二型糖尿病造模成功。由圖1可知實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠在 2 h 內(nèi)對(duì)葡萄糖表現(xiàn)出耐受，表明二型糖尿病造模成功，可進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

圖1 三黃瀉心湯給藥前對(duì)糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影響

3.2 體重

實(shí)驗(yàn)組大鼠從購(gòu)入到治療結(jié)束共計(jì)18 w，本實(shí)驗(yàn)記錄了18 w大鼠的體重變化（表1）。由表1 可以看出，造模前 SD 大鼠的體重始終呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，造模后其趨勢(shì)放緩，并在造模后(7～10 w)體重出現(xiàn)降低。給藥 8 w 后（即11～16 w），NC組大鼠體重平均增加了135 g，XXD 組、 MH 組和 DM組體重均沒有正常組增加快， XXD組體重平均增加了 32 g，MH 組體重平均增加了 9 g，DM組大鼠體重平均增加了49 g；與正常組比較均表現(xiàn)出極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。

表1 大鼠體重記錄（x±s，n=8；單位：g）

注：與NC組比較，*P＜0.05 , **P＜0.01, ***P＜0.001

3.3 飲水量

糖尿病大鼠由于血糖升高導(dǎo)致尿糖增加，尿糖增加引起尿滲透壓升高，滲透利尿引發(fā)多尿現(xiàn)象，多尿再引起體內(nèi)血容量減少，進(jìn)而引起血漿滲透壓升高，刺激口渴中樞，引起口渴，并導(dǎo)致多飲。由表2可以明顯看出，在造模后，大鼠的飲水量出現(xiàn)了明顯的增加，平均模型組每組每只大鼠的飲水量比正常組平均增加了約75～125 mL。給藥8 w，正常大鼠的飲水量基本保持在一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)，DM組飲水量有下降趨勢(shì)，每只模型大鼠的飲水量平均減少了40 mL ；而XXD組每只大鼠的飲水量平均減少了71 mL，MH組每只大鼠的飲水量平均減少了75 mL，兩組的飲水量均表現(xiàn)出明顯的降低趨勢(shì)，具有極顯著差異（P＜0.001）。

表2 給藥后大鼠飲水量記錄（x±s，n=8；單位：mL）

3.4 進(jìn)食量

由于大量的排尿，導(dǎo)致體內(nèi)糖分丟失嚴(yán)重，機(jī)體始終處于饑餓狀態(tài)，因此導(dǎo)致糖尿病患者多食多餐。由表3可知，給與 STZ 造模后，大鼠進(jìn)食量增加。給藥8 w，正常大鼠的進(jìn)食量基本保持在一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)，DM組大鼠進(jìn)食量平均增加了1.1 g；而XXD組大鼠進(jìn)食量平均減少了6.1 g，MH組大鼠進(jìn)食量平均減少了12.3 g，兩組的進(jìn)食量均表現(xiàn)出明顯的降低趨勢(shì)，具有極顯著差異（P＜0.001）。

表3 給藥后每組每只大鼠進(jìn)食量記錄（x±s，n=8；單位：g）

3.5 空腹血糖 FBG

對(duì)大鼠采用白天禁食 6～8 h，取其尾靜脈血，測(cè)定其空腹血糖濃度。由表4可知，采用50 mg·kg-1的 STZ 對(duì)大鼠進(jìn)行糖尿病造模，在一個(gè)月內(nèi)可以達(dá)到預(yù)期水平，實(shí)驗(yàn)大鼠基本處于高血糖狀態(tài)。給藥8 w，正常大鼠的進(jìn)食量基本保持在一個(gè)較穩(wěn)定正常血糖值的狀態(tài)（5～7 mmol·L-1），DM組大鼠空腹血糖值平均降低了4.1 mmol·L-1，有一定程度的降低趨勢(shì)；而XXD組大鼠空腹血糖值平均降低了7.5 mmol·L-1，MH組大鼠空腹血糖值平均降低了7.1 mmol·L-1，兩組的FBG均表現(xiàn)了明顯的降低趨勢(shì)，具有極顯著差異（P＜0.001）。

表4 給藥后大鼠空腹6h血糖記錄(x±s，n=8；單位：mmol·L-1)

3.6 大鼠口服葡萄糖耐量

葡萄糖耐受表明了身體對(duì)血糖濃度的調(diào)節(jié)能力，正常情況下，機(jī)體攝入葡萄糖后，或誘導(dǎo)胰島素的分泌，進(jìn)而達(dá)到降低血糖的目的，然而，糖尿病患者體內(nèi)由于胰島素的相對(duì)或者絕對(duì)缺乏，導(dǎo)致其降血糖能力大大降低。因此，在給予葡萄糖注射后，其血糖會(huì)出現(xiàn)久高不下的現(xiàn)象。在給藥0、4、8 w將實(shí)驗(yàn)大鼠隔夜禁食12 h后，給予每組大鼠灌胃40%的葡萄糖溶液，然后測(cè)定0，30，60，90，120 min內(nèi)大鼠的血糖值，觀察其葡萄糖耐受能力。由圖2可知，正常對(duì)照組大鼠糖耐量正常，口服葡萄糖后，其血糖值在 30 min 達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，并在120 min內(nèi)恢復(fù)到正常水平；模型組糖尿病大鼠血糖值在 30 min 也達(dá)到峰值，但其后一直維持在較高水平（≥20 mmol·L-1），表明其糖耐量受損，說明胰島素的作用減弱，可能是由于胰島素缺乏或者是胰島素敏感性降低導(dǎo)致。與模型組糖尿病大鼠比較，灌胃三黃瀉心湯和二甲雙胍 8 w后，其血糖值在 30 min達(dá)到峰值，隨后以較快速度下降，但未能恢復(fù)到初始水平，表明三黃瀉心湯和二甲雙胍可改善糖尿病大鼠的糖耐量。由圖3可知，糖尿病模型組大鼠較正常組大鼠AUC增加了4.77倍，而灌胃三黃瀉心湯和二甲雙胍8 w后其AUC分別降低了11.72%和13.23%（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了三黃瀉心湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠機(jī)體糖代謝紊亂的改善作用。

圖2 三黃瀉心湯對(duì)糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影響

圖3 三黃瀉心湯給藥8w對(duì)糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影響

4 討論

4.1 高糖高脂飼料+鏈脲佐菌素所致的糖尿病大鼠模型成功

糖尿病是當(dāng)今世界備受關(guān)注的重大慢性疾病，其發(fā)病人數(shù)多，范圍廣，在世界范圍內(nèi)共計(jì)有超過4億人患有糖尿病，其中 90%以上為Ⅱ 型糖尿病[11～12]。糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，由于現(xiàn)代社會(huì)人們生活水平的提升，飲食習(xí)慣更偏向于肉食的轉(zhuǎn)變，工作壓力的增加以及身體鍛煉的缺乏，導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病發(fā)病率極高，在中國(guó)有近1億的成年人患有Ⅱ 型糖尿病，老年患病人數(shù)尤甚。在藥理、藥效、藥物代謝的研究過程中，因?yàn)樾枰玫馁N近實(shí)際情況，常常采用相對(duì)應(yīng)的病理動(dòng)物模型進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)旨在通過鏈脲佐菌素（STZ）結(jié)合高熱量飼料建立一種Ⅱ型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建方法。實(shí)驗(yàn)選取 90±10 g 的SD 雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用高脂高糖飼料喂食一月，誘導(dǎo)其產(chǎn)生胰島素抵抗，然后腹腔注射50 mg·kg-1的 STZ，繼續(xù)喂食高脂高糖飼料一月后，對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，主要檢測(cè)指標(biāo)包括體重、飲水量、進(jìn)食量、空腹血糖濃度和口服葡萄糖耐受。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此劑量下的STZ 對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的毒害作用適中，導(dǎo)致的死亡率不足 10%。通過對(duì)其體重、飲水量、進(jìn)食量的長(zhǎng)期監(jiān)控，以及觀察其排尿量，造模后的大鼠出現(xiàn)了典型的“三多一少”癥狀，這一點(diǎn)符合糖尿病癥狀。模型大鼠空腹血糖始終高于正常水平，在造模4 w 后，其平均血糖濃度高于 20 mmol·L-1。高血糖意味著糖尿病的產(chǎn)生，因此實(shí)驗(yàn)方法能夠建立科學(xué)合理的Ⅱ 型糖尿病大鼠模型。

4.2 三黃瀉心湯對(duì)Ⅱ 型糖尿病大鼠的降血糖作用研究

本課題采用三黃瀉心湯臨床治療糖尿病的劑量來開展實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型大鼠的降血糖研究，通過8 w 的治療時(shí)間發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠空腹血糖和口服葡萄糖耐量得到了顯著的改善，體重也有所增加。因此，三黃瀉心湯對(duì)Ⅱ 型糖尿病大鼠具有明顯的降血糖作用。但是降血糖并不是糖尿病的唯一指標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)后續(xù)還要開展三黃瀉心湯對(duì)糖尿病大鼠的降血糖的機(jī)制研究，以及相關(guān)病理學(xué)指標(biāo)研究，以期綜合評(píng)價(jià)三黃瀉心湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠的降血糖作用。

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