趙亞飛 ，唐勇 ，高婷 ，王詩惠 ，戴樂舒 ，宋劍濤

近年來，由社會經(jīng)濟和科學技術的飛速發(fā)展帶來的的光污染等問題對人類視力健康的危害日益突出，已引起了眼科界的重視。人視網(wǎng)膜一旦遭受強光或者長時間的光暴露，超出其自身的承受能力，則發(fā)生視網(wǎng)膜光損傷改變[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，除了日常光照、LED燈光等生活中的光暴露之外，眼科光學診療儀器的光源亦是引起視網(wǎng)膜光損傷的重要原因。如不采取積極有效的措施對視網(wǎng)膜光損傷進行干預，則會導致視網(wǎng)膜光損傷的進一步加重，出現(xiàn)視力受損等癥狀，后期還可以發(fā)展成為年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD） 等疾病，甚至視力完全喪失[3]。而在動物實驗研究中，小鼠視網(wǎng)膜光損傷（light damage，LD）模型為AMD模型之一，對視網(wǎng)膜光損傷研究的作用機制具有十分重要的研究意義。前期實驗證實，小檗堿（Berberine，BBR）具有良好抗視網(wǎng)膜光損傷氧化應激的作用[4]。因此，我們沿用前期實驗的造模及干預方法，進一步觀察基于小膠質(zhì)細胞及其P2X4受體參與，小檗堿抗小鼠視網(wǎng)膜光損傷氧化應激作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康清潔級C57BL/6J小鼠，雄性，10周齡，體重20±2g，隨機分為空白組、光損傷模型組（LD組）、小檗堿治療組（BBR組）三組，每組各6只。實驗動物抵達實驗室后，適應性飼養(yǎng)一周，每籠4只動物，期間自由進食、飲水，節(jié)律光照：12h明(7:00-19:00)/12 h暗（19:00-7:00）。實驗動物飼養(yǎng)間保持濕度和溫度相對穩(wěn)定，濕度在70%左右，溫度23±1℃?？瞻捉M不做任何處理，BBR組先給予200 mg/Kg/d BBR灌胃7 d，LD組不給予藥物干預，7 d后LD組及BBR組小鼠給予LED冷光燈照射建模。48 h后通過HE、TUNEL檢測確定光損傷模型建立成功。

1.2 光損傷模型建立

基于本課題組以往發(fā)表的文獻[4]，小鼠放在自制LED冷光燈的光損傷裝置（如圖1）中，給予4 h光照，平均照度為光照度為10000±1500 Lux，光照箱內(nèi)溫度為28～32℃，光照時間為12:00～16:00。造模完成后送回動物房。

圖1 自制光損傷裝置圖

1.3 HE檢測

光損傷模型建立后48 h，摘取小鼠眼球，切片染色，觀察視網(wǎng)膜細胞形態(tài)，并比較ONL層厚度。

1.4 TUNEL檢測

用TUNEL方法觀察小鼠視網(wǎng)膜ONL細胞凋亡情況。光損傷模型建立48 h后取小鼠眼球切片、檢測。ONL層細胞凋亡率按照選定區(qū)域的（TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%計算，每張切片選取三處進行計算。

1.5 免疫熒光雙標法檢測

以1:100比例稀釋anti-AIF1/Iba1（Arigo公司，批號：ARG63338），與二抗抗羊IgG結合，標記小膠質(zhì)細胞；以1:50比例稀釋anti-P2Rx4（Alomone公司，批號APR002），與二抗山羊抗兔IgG結合，標記P2X4的陽性表達細胞。觀察小膠質(zhì)細胞及P2X4受體在三組小鼠視網(wǎng)膜中的分布，并統(tǒng)計400×鏡下視網(wǎng)膜ONL層的陽性表達數(shù)。光損傷模型建立48 h后取小鼠眼球檢測上述指標。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標準差（xˉ±s）表示。運用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，故組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。當P<0.05，則認為兩組比較具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 小鼠視網(wǎng)膜HE染色結果

光鏡下觀察C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜各層細胞分布及排列，比較外核層厚度，結果如下（圖2）：

空白組：視網(wǎng)膜形態(tài)正常，各層結構層次分明。神經(jīng)節(jié)細胞核排列整齊；內(nèi)核層、外核層細胞核排列緊密，染色均勻，細胞核形態(tài)完整；光感受器細胞內(nèi)外節(jié)排列規(guī)則，分界清晰。外核層厚度為60.75±6.82μm。

LD組：部分神經(jīng)節(jié)細胞核縮小，染色加深，疏松樣排列；內(nèi)核層細胞核排列緊密、整齊；外核層細胞核排列紊亂，部分細胞核濃縮、聚集、染色加深；光感受器細胞內(nèi)、外節(jié)排列稍紊亂，視桿外節(jié)排列紊亂，膜盤間隙部分斷裂。外核層厚度為50.36±11.58μm。

BBR組：視網(wǎng)膜形態(tài)略有異常，結構層次分明。神經(jīng)節(jié)細胞核排列稍稀疏；內(nèi)核層、外核層細胞核排列緊密，染色均勻，細胞核形態(tài)完整；光感受器細胞內(nèi)外節(jié)排列稍紊亂。外核層厚度為59.10±5.69μm。

2.2 TUNEL檢測外核層細胞凋亡

空白組小鼠視網(wǎng)膜組織未見細胞凋亡 (圖3A)；光照48 h后LD組小鼠視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)TUNEL陽性細胞表達，呈棕黃色染色(圖3B)，陽性細胞核皺縮，染色質(zhì)凝聚成致密的塊狀，呈現(xiàn)“新月形”“馬蹄狀”等染色質(zhì)邊集的典型細胞調(diào)亡；BBR組小鼠視網(wǎng)膜組織見少量細胞凋亡(圖3C)。LD組1例眼球切片因眼球結構不完整未納入。

小鼠視網(wǎng)膜ONL層凋亡數(shù)為：空白對照組2.60±0.34 個/高倍視野；LD 組為 75.20±6.49 個/高倍視野；BBR組為9.33±1.02個/高倍視野。采用ANO-VA統(tǒng)計方法比較，與空白組比較，LD組P=0.001，P＜0.01，有統(tǒng)計學差異；BBR 組 P=0.011，P＜0.05，有統(tǒng)計學差異。BBR組與LD比較，P=0.001，P＜0.01，有著統(tǒng)計學差異（圖4）。

2.3 免疫熒光雙標法分析小膠質(zhì)細胞和P2X4的共表達

用anti-AIF1/Iba1標記小膠質(zhì)細胞，同時用P2X4進行雙標，觀察到小膠質(zhì)細胞 （綠色熒光）和P2X4標記物（紅色熒光）在視網(wǎng)膜中存在共定位（圖5）。CTR組與BBR組均有1例切片因眼球結構不完整而未納入。小鼠視網(wǎng)膜ONL層小膠質(zhì)細胞數(shù)為：空白對照組4.80±1.11個/高倍視野；LD組為20.00±1.48個/高倍視野；BBR 組為 4.00±0.55個/高倍視野。采用ANOVA統(tǒng)計方法比較，與空白組比較，LD組 P=0.000，P＜0.01， 有統(tǒng)計學差異；BBR 組 P=0.651，P＞0.05，無統(tǒng)計學差異。BBR組與LD比較，P=0.000，P＜0.01，有統(tǒng)計學差異（圖 6）。

小鼠視網(wǎng)膜ONL層P2X4陽性細胞數(shù)為：空白對照組 8.20±3.90個/高倍視野；LD組為 24.50±13.97個/高倍視野；BBR 組為 5.40±2.70個/高倍視野。采用ANOVA統(tǒng)計方法比較，與空白組比較，LD組 P=0.011，P＜0.05， 有統(tǒng)計學差異；BBR 組 P=0.633，P＞0.05，無統(tǒng)計學差異。BBR組與LD比較，P=0.004，P＜0.01，有統(tǒng)計學差異（圖 7）。

3 討論

3.1 光損傷后視網(wǎng)膜出現(xiàn)細胞凋亡

過度的光暴露能夠引起視網(wǎng)膜損傷，是引起視力下降甚至發(fā)展成視網(wǎng)膜變性相關疾病的重要病因。大量研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜的光化學損傷的發(fā)生與視紫紅質(zhì)的含量異常、氧自由基和脂質(zhì)過氧化物的大量生成、Muller細胞功能異常、凋亡相關基因異常表達等有關[5]，而這些病理改變均能引起視網(wǎng)膜感光細胞的大量凋亡。也就是說，視網(wǎng)膜光損傷的核心病理環(huán)節(jié)是視網(wǎng)膜細胞的異常凋亡。本研究結果顯示，給予強光照射后，LD組小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量細胞凋亡；而BBR干預后，小鼠視網(wǎng)膜凋亡減輕。

3.2 小膠質(zhì)細胞在視網(wǎng)膜光損傷中有重要作用

小膠質(zhì)細胞在AMD的氧化應激過程中扮演重要角色。其約占全部視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞的10%～20%，對視網(wǎng)膜細胞起保護、營養(yǎng)和屏障作用[6]。當視網(wǎng)膜遭受光損傷、AMD等病理狀態(tài)時，小膠質(zhì)細胞被視網(wǎng)膜局部炎癥因子和神經(jīng)變性產(chǎn)物激活，迅速向視網(wǎng)膜受損部位遷移，吞噬含有視紫紅質(zhì)的視網(wǎng)膜細胞碎片及β-淀粉樣蛋白（Aβ）[7]，維護視網(wǎng)膜內(nèi)的穩(wěn)定。作為視網(wǎng)膜的固有免疫細胞，小膠質(zhì)細胞活化在視網(wǎng)膜的過度氧化應激引起的免疫相關性損傷中具有重要作用。

圖2 小鼠視網(wǎng)膜HE染色情況注。2A空白組；2BLD組光照48 h后視網(wǎng)膜全層圖；2C組BBR組小鼠視網(wǎng)膜全層圖。GCL（Ganglion Cell Layer），神經(jīng)節(jié)細胞層；INL（Inner Nuclear Layer），內(nèi)核層；ONL（Outer Nuclear Layer），外核層

圖3 小鼠視網(wǎng)膜切片TUNEL染色(×400)。3A空白組；3BLD組視網(wǎng)膜，黑色箭頭指示視網(wǎng)膜細胞中的凋亡細胞。LD組小鼠光照48h后，視網(wǎng)膜出現(xiàn)凋亡細胞；3CBBR組視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜凋亡細胞數(shù)量較少。GCL（Ganglion Cell Layer），神經(jīng)節(jié)細胞層；INL（Inner Nuclear Layer），內(nèi)核層；ONL（Outer Nuclear Layer），外核層

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜ONL層細胞凋亡率。*LD組、BBR 組與空白組比較，P＜0.05。**LD 組、BBR 組與空白組比較，P＜0.01。##BBR組與LD組比較P＜0.01。

圖5 小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞及P2X4的表達。A-L視網(wǎng)膜免疫熒光標記圖：A,D,G,J為空白組，B,E,H,K為LD組光照48h后視網(wǎng)膜全層圖，C,F,I,L組為BBR組小鼠視網(wǎng)膜全層圖。紅色箭頭，小膠質(zhì)細胞；黃色箭頭，P2X4的陽性表達；白色箭頭小膠質(zhì)細胞和P2X4的共表達。Microglia：小膠質(zhì)細胞；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)

圖6 各組小鼠視網(wǎng)膜ONL層小膠質(zhì)細胞陽性數(shù)。*LD組、BBR組與空白組比較P＜0.05。#BBR組與LD組比較P＜0.05。

圖7 各組小鼠視網(wǎng)膜ONL層P2X4陽性細胞數(shù)。*LD組、BBR組與空白組比較P＜0.05。#BBR組與LD組比較P＜0.05。

在本研究中，視網(wǎng)膜光損傷模型小鼠ONL的小膠質(zhì)細胞數(shù)量升高，而BBR組小鼠降低。這提示，小膠質(zhì)細胞向ONL定向遷移和過度活化參與視網(wǎng)膜光損傷的病理過程，而BBR能夠抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化，這可能是BBR能夠抑制ONL的視細胞凋亡的重要生物學基礎。

3.3 P2X4受體可能參與視網(wǎng)膜光損傷的作用機制

隨著研究的逐步深入，有證據(jù)表明小膠質(zhì)細胞的激活與嘌呤信號傳遞系統(tǒng)關系密切，尤以P2X4受體最為重要。作為三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate,ATP）的門控陽離子通道，P2X4受體廣泛存在于小膠質(zhì)細胞，參與對小膠質(zhì)細胞的激活和存活的調(diào)控[6]。如在多發(fā)性硬化（multiplesclerosis,MS）的視神經(jīng)中，脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導的神經(jīng)炎的脊髓中均存在小膠質(zhì)細胞的活化及P2X4表達的增加[8,9]。而在視網(wǎng)膜光損傷中，傷害性光刺激能夠促使Muller細胞釋放ATP，釋放到胞外的ATP隨后與小膠質(zhì)細胞上的P2X4受體相結合，將小膠質(zhì)細胞從靜息態(tài)被激活，并釋放一系列促炎因子（IL-1 β、TNF-α、COX-2 和 MMPs等），并誘使氧化應激反應的發(fā)生[10,11]。有研究指出，給予P2X4受體阻斷劑能夠明顯減少小膠質(zhì)細胞的細胞凋亡和促炎因子TNF-α的分泌，而P2X4受體激動劑則能夠明顯增加小膠質(zhì)細胞的凋亡[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜光損傷模型小鼠ONL的小膠質(zhì)細胞數(shù)目和P2X4受體陽性細胞數(shù)目均增加，而給予BBR處理可以降低小膠質(zhì)細胞數(shù)目和P2X4受體陽性細胞數(shù)目。這提示，P2X4介導的小膠質(zhì)細胞的活化和增殖可能是視網(wǎng)膜光損傷的重要病理機制，而BBR能夠降低P2X4受體的表達水平，從而抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化，產(chǎn)生視網(wǎng)膜保護作用，這與P2X4受體阻斷具有相似效應。

3.4 小檗堿可有效緩解視網(wǎng)膜光損傷

大量研究表明，小檗堿是一種具有較強抗氧化和抗炎活性的中藥提取物，廣泛用于感染、炎癥性損傷、糖代謝異常等與氧化應激過度密切相關的各種疾病的治療[13,14]。如小檗堿可以抑制糖尿病患者視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的凋亡，從而改善糖尿病性視網(wǎng)膜病變[15]。本課題組前期以小檗堿干預急性光損傷小鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)：光損傷模型小鼠的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞活化遷移；給予小檗堿治療后，小鼠視網(wǎng)膜損傷減輕，氧化應激指標Hmox1、Cp的mRNA水平下降，炎癥指標Aif1的mRNA水平亦明顯降低，這提示小檗堿對光誘導的小鼠視網(wǎng)膜感光細胞的退變具有良好的保護作用，是一種潛在的抗視網(wǎng)膜光損傷的治療選擇[4]。

本研究發(fā)現(xiàn)，光損傷模型小鼠的視網(wǎng)膜外核層厚度變薄，凋亡細胞數(shù)量明顯增加，而給予小檗堿干預后，光損傷小鼠的外核層厚度增加，細胞凋亡數(shù)量明顯減少。這提示，小檗堿能夠減輕視網(wǎng)膜光損傷的影響，降低細胞凋亡數(shù)量，從而發(fā)揮保護視網(wǎng)膜的作用。這與課題組前期研究成果有相似性，即小檗堿干預能夠減輕急性光損傷小鼠模型視網(wǎng)膜損傷，減輕視網(wǎng)膜氧化應激反應和炎癥反應。綜上可知，小檗堿對光誘導的視網(wǎng)細胞膜損傷具有良好的保護作用，是一種潛在的抗視網(wǎng)膜光損傷的新的治療選擇。

[1] 劉貴亭,呂東偉,呂傳東,等.電焊致視網(wǎng)膜光損傷3例[J].臨床眼科雜志,2015,(06):571-572.

[2] 姜嚴明.視網(wǎng)膜光損傷防治的研究進展 [J].中國實用眼科雜志,2002,(03):166-168.

[3]Marquioni-Ramella MD,Suburo AM.Photo-damage,photo-protection and age-related macular degeneration[J].Photochem Photobiol Sci,2015,14(9):1560-1577.

[4] Song D,Song J,Wang C,et al.Berberine protects against light-induced photoreceptor degeneration in themouseretina.Experimental Eye Research,2015,(10)145:1-9.

[5] 彭華,董玉.視網(wǎng)膜光損傷發(fā)生機制及治療的研究進展[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育,2013,11(09):162-165.

[6] Squire LR.Encyclopedia of Neuroscience[M].Singapore:Elsevier,2010:373-380.

[7] 黃禮彬,徐國興.小膠質(zhì)細胞在年齡相關性黃斑變性中的作用[J].海峽科學,2015,8(104):3-7.

[8] Buschini E,Piras A,Nuzzi R,et al.Age related macular degeneration and drusen:neuroinflammation in the retina[J].Prog Neurobiol,2011,95(1):14-25.

[9] Vázquez-Villoldo N,Domercq M,Martín A,et al.P2X4 receptors control the fate and survival of activated microglia[J].GLIA,2014.62:171-184.

[10]Shi F,Zhou D,Ji Z,et al.Anti-arthritic activity of luteolin in Freund’s complete adjuvant-induced arthritis in rats by suppressing P2X4 pathway[J].Chem Biol Interact.2015,25(226):82-87.

[11]Burm SM,Zuiderwijk-Sick EA,Weert PM,et al.ATP-induced IL-1βsecretion is selectively impaired in microglia as compared to hematopoietic acrophages[J].Glia,2016,64(12):2231-2246.

[12]Karlstetter M,Scholz R,Rutar M,Wong WT,Provis JM,Langmann T.Retinal microglia:just bystander or target for therapy[J]?Prog Retin Eye Res.2015;45:30-57.

[13]D Robert,JHrvoje,M Vanja Vasiljev,et al.Resolution of liver fibrosisby isoquinolinealkaloid berberinein CCl4-intoxicated miceis mediated by suppression of oxidative stress and upregulation of MMP-2expression[J].Journalof Medicinal Food,2013,16(6):518-528

[14]Gao F,Gao Y,Liu YF.Berberineexerts an anticonvulsant effect and ameliorates memory impairment and oxidative stress in a pilocarpineinduced epilepsy model in the rat.[J].Neuropsychiatr Dis Treat,2014,10:2139-2145.

[15]Pei Tian,Hongyan Ge,Haitao Liu,et al.Leukocytes from diabetic patients kill retinal endothelial cells:Effects of berberine.Mol Vis,2013,19:2092-2105.