王捷，王巖，朱蕓

南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院1藥學(xué)部，2外科教研室，3心血管內(nèi)科，河南 南陽473000

乳腺癌是女性惡性腫瘤中占據(jù)比例較大且預(yù)后不佳的生殖系統(tǒng)疾病[1]。乳腺癌的發(fā)病原因與雌激素受體（estrogen receptor，ER）的作用密切相關(guān)[2]。ER表達(dá)的乳腺癌被稱為ER陽性乳腺癌[3]。他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）可與ER結(jié)合切斷雌激素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的刺激作用，是一種選擇性ER調(diào)節(jié)劑，可阻止癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]。但相關(guān)研究表明，僅僅抑制ER是不夠的，TAM具有類似雌激素的作用，能提高血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEFG）水平，提高腫瘤組織產(chǎn)生新生血管的能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[5]；同時(shí)還能提高基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）水平，協(xié)同增強(qiáng)新生血管的形成能力。本研究探討TAM對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

高糖DMEM培養(yǎng)基、無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DMSO培養(yǎng)基、TAM、明膠均購(gòu)自Sigma公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。儀器中CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；制膠、電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，Chemi Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)，CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃及5%CO2條件下孵育。待細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞分組及實(shí)驗(yàn)方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞。給藥前將耗竭細(xì)胞本身的內(nèi)源性雌激素改用無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將MCF-7細(xì)胞接種至6孔板中，過夜，直至細(xì)胞貼壁。設(shè)對(duì)照組、TAM組。對(duì)照組用無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，TAM組用含1 μmol/L TAM的無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，每組5個(gè)復(fù)孔。

1.5 Western blot法測(cè)定MMP- 9、MMP- 2、VEGF蛋白水平

采用BCA蛋白定量法測(cè)定MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白：向其中加入Loading Buffer在95℃條件下變性15 min，12 000 r/min離心10 min，保存于-80℃冰箱中用于蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。將每孔10 μl樣品加入含10%的十二烷基硫酸鈉（lauryl sodium sulfate，SDS）的聚丙烯凝膠中電泳分離90 min，分離完畢后切膠，制作三明治盒。冰水中轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗（Bcl-2、Bax、Actin，1∶1000）常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次12 min，二抗（1∶5000）常溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次8 min，加入ECL發(fā)光液后，轉(zhuǎn)入暗室，化學(xué)發(fā)光法曝光感光底片，顯影定影洗滌后烘干裁片保存。

1.6 RT-PCR 法 測(cè) 定 MMP- 9、MMP- 2、VEGF mRNA水平

按TRⅠzol試劑說明書要求提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照TaKaRa M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書。PCR反應(yīng)體系：cDNA1.0 μl，2×Premix Taq 10 μl，上、下游引物各10 pmol，加雙蒸水至總體積20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min預(yù)變性；94℃ 30 s變性，59℃45 s退火，72℃1 min延伸，34個(gè)循環(huán)；72℃延 伸 10 min。 β-actin 正 義 引 物 序 列 為 5′-TGGATCCTGTGGCAT-CCATGAAAC-3′，反義引物序列為5′-TAAAACG-CAGTAACAGTCC-3（′350 bp）；Bcl-2正義引物序列為5′-TGCACCTGACGCCCTTCA-3′，反義引物序列為 5′-AGA-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3（′291 bp）；Bcl-xL正義引 物 序 列 為5′-ATGTCTCAGAGCAACCGGGAGC-3′，反義為 5′-GCGATCCGACTCACCAATACCT-3（′500 bp）；XⅠAP正義引物序列為5′-ATGATACCATCTTCCAAAATCC-3′，反 義 為 5′-TTCTGTAATGAAGTCTGACTT-3（′200 bp）。PCR反應(yīng)結(jié)束取產(chǎn)物5 μl于12 g/L瓊脂糖凝膠電泳。采用Quantity One軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參照，以靶基因與β-actin光密度的比值作為mRNA的表達(dá)豐度，進(jìn)行半定量檢測(cè)。

1.7 Transwell法

采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，按照文獻(xiàn)[6]操作。各組MCF-7細(xì)胞侵襲能力=穿過Matrigel膠微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照穿過Matrigel膠微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)-計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、MMP- 9、MMP- 2蛋白表達(dá)水平的比較

TAM組MCF-7細(xì)胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組MCF- 7細(xì)胞中VEGF、MMP- 9、MMP- 2蛋白表達(dá)水平的比較（%，±s）

表1 兩組MCF- 7細(xì)胞中VEGF、MMP- 9、MMP- 2蛋白表達(dá)水平的比較（%，±s）

組別對(duì)照組TAM組t值P值VEGF 100.4±2.1 157.9±13.6 10.235＜0.01 MMP-9 100.9±3.3 181.2±23.8 8.186＜0.01 MMP-2 100.0±1.6 172.4±21.5 8.226＜0.01

2.2 VEGF、MMP- 9、MMP- 2 mRNA表達(dá)水平的比較

TAM 組 MCF-7細(xì)胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 兩組MCF- 7細(xì)胞中VEG-F、MMP- 9、MMP- 2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較（x± s）

2.3 細(xì)胞侵襲能力的比較

TAM組MCF-7細(xì)胞的侵襲能力相對(duì)數(shù)為（34.9±5.9），明顯高于對(duì)照組的（12.6±3.4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.022，P＜0.01）。（圖1）

圖1 兩組MCF- 7細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（HE染色，×400）

3 討論

乳腺癌是臨床上常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，對(duì)中國(guó)女性的健康危害極大。目前常采用內(nèi)分泌治療并取得較滿意的效果。雌激素通過調(diào)節(jié)或拮抗經(jīng)典的雌激素受體ER-α、ER-β所參與的各個(gè)生理過程來實(shí)現(xiàn)降低乳腺癌細(xì)胞中抗凋亡的Bcl-2表達(dá)，增加促凋亡的Bax表達(dá)能力，從而促使癌細(xì)胞凋亡[7]。TAM為一種非固醇類ER拮抗藥，通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制ER發(fā)揮抑制增殖分化的能力從而治療乳腺癌[8]。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TAM也發(fā)揮類似雌激素作用[8]，主要體現(xiàn)在其活性代謝產(chǎn)物4-羥基他莫昔芬（4-OHT）具有雌激素樣作用，可促進(jìn)ER-α陰性乳腺癌SR-BR-3細(xì)胞的增殖，同時(shí)可增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌Tshikawa和KLE細(xì)胞的增殖與侵襲能力，提高其MMP-9、MMP-2蛋白及MMP-9、MMP-2mRNA的表達(dá)和活性[9]。提示拮抗ER-α受體治療乳腺癌具有一定的局限性，需輔助抑制相關(guān)雌激素樣作用，降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

腫瘤組織生長(zhǎng)的關(guān)鍵是形成新生血管。VEGF是一種具有強(qiáng)作用的促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂劑[10]。與相應(yīng)受體結(jié)合后刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，形成新的血管和基質(zhì)。研究報(bào)道，VEGF表達(dá)與乳腺癌預(yù)后有關(guān)，高水平的VEGF可促進(jìn)乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。有學(xué)者認(rèn)為乳腺癌中VEGF的表達(dá)與MMP-2、MMP-9有關(guān)，提示VEGF、MMP-2、MMP-9在乳腺癌中協(xié)同刺激腫瘤血管形成，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]。本研究結(jié)果顯示，TAM組MCF-7細(xì)胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TAM組MCF-7細(xì)胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明TAM在拮抗ER-α受體的同時(shí)，發(fā)揮雌激素樣作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后效果。

目前研究TAM的耐藥機(jī)制可能為：①ER-α的突變與缺失，主要由于部分耐藥腫瘤細(xì)胞編碼ER-α 351位酪氨酸基因突變，被天冬氨酸占據(jù)。②ER-β表達(dá)的變化，李鵬程等[13]報(bào)道由Fos-Jun異源二聚體與Jun-Jun同源二聚體組成的AP-1轉(zhuǎn)錄因子，通過AP-1位點(diǎn)途徑的作用，使ER-β異常激活或過度表達(dá)，引起乳腺癌患者耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。③生長(zhǎng)因子信號(hào)通路激活ER，ER和生長(zhǎng)因子受體通路之間存在相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中ER-α、ER-β的高表達(dá)可增加生長(zhǎng)因子信號(hào)蛋白（EGFR/HER2）及下游MAPK的活性，通過EGFR-Ras-Raf-MAPK磷酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使ER A/B區(qū)的第118位絲氨酸磷酸化，ER以配體非依賴性的方式被激活[14]。④細(xì)胞激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，PⅠ3K/AKT/MTOR和MAPK/EPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的傳導(dǎo)通路，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MAPK和AKT作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，可直接激活ER，是導(dǎo)致內(nèi)分泌治療耐受的關(guān)鍵原因。

本研究結(jié)果顯示，TAM組MCF-7細(xì)胞的侵襲能力相對(duì)數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其機(jī)制可能與提高Bcl-2表達(dá)水平，降低BAX水平有關(guān)。在不利因素環(huán)境下，細(xì)胞會(huì)在基因調(diào)控下發(fā)生自動(dòng)死亡，此過程為凋亡，對(duì)維持細(xì)胞正?；顒?dòng)具有重要意義。凋亡過程與Bcl-2家族和促凋亡蛋白（BAX）關(guān)系密切。Bcl-2可維持線粒體外膜的完整性，防止線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C等促凋亡分子進(jìn)入細(xì)胞。BAX則可破壞線粒體外膜的完整性，促進(jìn)各種凋亡分子進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮促凋亡作用。正常情況下，Bcl-2和BAX形成二聚體，作為調(diào)控細(xì)胞凋亡過程的開關(guān)。當(dāng)外界條件刺激，二聚體分離，抑制細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，繼而引發(fā)腫瘤。已有研究證實(shí)，TAM作用于MCF-7細(xì)胞可提高乳腺癌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平，降低BAX表達(dá)水平[15]。與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，TAM可能發(fā)揮類雌激素功能，促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力，這與其提高M(jìn)CF-7細(xì)胞中VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1]Wynder EL,Rose DP,Cohen LA.Diet and breast cancer in causation and therapy[J].Cancer,1986,58(8 Suppl):1804-1813.

[2]廉馨,史丹,李洪艷.新型雌激素受體ER-α36與乳腺癌[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2015,31(1):34-37.

[3]楊成成,南克俊,張雅敏,等.細(xì)胞周期蛋白D1的高表達(dá)與雌激素受體表達(dá)及乳腺癌患者良好預(yù)后相關(guān)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2016,32(1):84-87.

[4]蘭瑛,胡蝶,何琴.托瑞米芬對(duì)比他莫昔芬治療乳腺癌安全性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)藥房,2017,28(3):360-364.

[5]陳妍,王婧,徐旖旎,等.他莫昔芬對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力、MMP-9活性和表達(dá)的影響及機(jī)制[J].山東醫(yī)藥,2016,56(26):6-9.

[6]盧科蓮,喻小蘭,夏紀(jì)毅,等.黃芩素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制探討[J].山東醫(yī)藥,2014,54(27):4-7.

[7]許巖磊,陳曦琰,陳緒,等.三黃煎劑抑制Aurora激酶A增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)他莫昔芬治療敏感性的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2015,26(12):2826-2829.

[8]朱慶,伍俊儀,袁杰,等.新型雌激素受體GPER在乳腺癌MCF-7細(xì)胞他莫昔芬耐藥中的作用及機(jī)制[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,37(22):2249-2254.

[9]陳海霞,周業(yè)江,王璐璐,等.他莫昔芬對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖和絲氨酸蛋白酶抑制劑9表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(7):873-875;879.

[10]朱振浩,陳家樂,伍麗青,等.miRNA參與的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其信號(hào)通路調(diào)控在腫瘤血管生成中作用的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué),2016,37(1):136-139.

[11]劉清華,于國(guó)華,劉雨清.CCR7和VEGF-C蛋白與乳腺癌預(yù)后之間的關(guān)系[J].中國(guó)病理生理雜志,2016,32(8):1457-1460;1465.

[12]張紅霞,李洪利.乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中PTTG與MMP-2和MMP-9的表達(dá)及相關(guān)性[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2015,31(6):616-623.

[13]李鵬程,劉玉玲,黨群,等.巴多昔芬對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位內(nèi)膜組織中ERα、ERβ、AP-1、VEGF表達(dá)的影響[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2016,51(7):541-543.

[14]鄧婷婷,鄒嬌,陳彬,等.ER-α36對(duì)乳腺癌細(xì)胞Herceptin敏感性的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,37(11):1080-1085.

[15]金偉,袁媛,湯繼春,等.他莫昔芬與辛伐他汀對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的協(xié)同效應(yīng)及機(jī)制[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017,52(5):677-681.