范文強(qiáng)，姬宇宙，劉先本

1焦作市第二人民醫(yī)院心胸外科，河南 焦作454001

2河南省腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤一區(qū)，鄭州450008

肺癌是惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要危險(xiǎn)因素，是全球主要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)之一，僅在中國(guó)，每年肺癌相關(guān)的發(fā)病和病死患者分別約為70萬(wàn)例和60萬(wàn)例[1-2]。目前，大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)已處于晚期階段，5年生存率僅為15%，而早期肺癌患者的5年生存率為30%～40%，因此，早期診斷和有效治療可明顯延長(zhǎng)肺癌患者的生存期[2]。在功能上，Wnt蛋白可參與腫瘤的發(fā)生和胚胎的發(fā)育，包括細(xì)胞命運(yùn)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)[3-4]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（low density lipoprotein receptor related protein 6，LRP6）是LRP超家族成員之一，Wnt的共受體在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著主要的作用[5-6]。LRP6蛋白可與Frizzled家族成員結(jié)合，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路被激活，進(jìn)而導(dǎo)致β-catenin的穩(wěn)定性和核易位增強(qiáng)，而LRP6的異常表達(dá)可影響Wnt配體與LRP和Frizzled家族成員結(jié)合，進(jìn)而影響受體活化以及腫瘤的進(jìn)展、惡化[2]。采用抑制劑阻斷Wnt配體與LRP6中的Wnt結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路及其下游基因被抑制[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在小雞和斑馬魚(yú)中，Wnt1的異常表達(dá)可通過(guò)Lmx1b、Pax2和En2途徑調(diào)控FGF8的表達(dá)[8-9]，而FGF8可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞的克隆形成能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[10]。因此，在本研究中，猜測(cè)LRP6作為一種癌蛋白，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)FGF8信號(hào)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步揭示LRP6在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，首先利用Western blot法檢測(cè)了其在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)；然后，通過(guò)在細(xì)胞中沉默LRP6表達(dá)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響；最后，研究其是否通過(guò)FGF8信號(hào)來(lái)發(fā)揮癌基因的作用。本研究將闡明LRP6在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，為臨床將LRP6與FGF8作為診斷、治療肺癌的靶標(biāo)奠定研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

正常肺細(xì)胞CCD-19Lu和肺癌細(xì)胞A549、H1299、SPCA-1、L78、PCL3、H460均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與儀器

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、MEM培養(yǎng)基、RPMⅠ-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；siRNA（small interfering RNA，siRNA）-LRP6和siRNA-control由上海GenePharma公司合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Ⅰnvitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒均購(gòu)自大連Takara公司；7300實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RⅠPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗 LRP6（ab118490）、FGF8（ab89550）、β-actin（ab8245）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常肺細(xì)胞CCD-19Lu采用含10%FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，肺癌細(xì)胞A549、H1299、SPCA-1、L78、PCL3、H460采用含10%FBS的RPMⅠ-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LRP6在肺癌細(xì)胞A549中的相對(duì)表達(dá)量最高，因此后續(xù)研究將A549作為研究對(duì)象。將siRNA-LRP6和siRNA-control按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分別記為siRNA-LRP6組和siRNA-control組。siRNA-LRP6序列：5'-CCG CAT GGT GAT TGA TGA A-3'；siRNA-control序列：5'-UUC UCC GAA CGU GUC CGG A-3'。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè) 采用Trizol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用Prime-Script RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒在7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。LRP6 PCR擴(kuò)增引物：上游5'-GAG CTG GAC TGT TAT CCA ACT G-3'和下游5'-CTT CAT ACG AGG ACA CAG CAT C-3'；β-actin引物：上游5'-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3'和下游5'-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3'。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。以LRP6/β-actin計(jì)算LRP6的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)按照先前研究報(bào)道的方案進(jìn)行[11]。將siRNA-LRP6或siRNA-control轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，于24、48、72 h時(shí)分別加入MTT進(jìn)行測(cè)定，在波長(zhǎng)490 nm處采用酶標(biāo)儀測(cè)定各組光密度（optical density，OD）值。克隆形成測(cè)定按照以下步驟進(jìn)行：轉(zhuǎn)染48 h后，取500個(gè)A549細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)10～14 d后，采用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè) 按照先前報(bào)道所述的方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)[13]，收集細(xì)胞，RⅠPA裂解液裂解，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白含量，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，將膜與抗體（LRP6、FGF8、β-actin）進(jìn)行室溫孵育2 h，最后曝光顯影。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LRP 6在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

LRP6在肺癌細(xì)胞L78、A549、H1299、SPCA-1、PCL3和H460中的表達(dá)水平均明顯高于LRP6在正常肺細(xì)胞CCD-19Lu中的表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 LRP 6蛋白在肺癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量（±s）

表1 LRP 6蛋白在肺癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量（±s）

細(xì)胞CCD-19Lu L78 A549 H1299 SPCA-1 PCL3 H460 LRP6蛋白相對(duì)表達(dá)量0.22±0.04 0.87±0.07 1.21±0.06 1.02±0.09 1.19±0.09 0.57±0.03 0.78±0.08

2.2 siRNA沉默LRP 6表達(dá)

轉(zhuǎn)染siRNA-LRP6后，A549細(xì)胞中LRP6mRNA和LRP6蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.22±0.04）和（0.14±0.01），均明顯低于siRNA-control組的（0.94±0.07）和（0.39±0.03），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.468、13.693，P＜0.01）。（圖1）

2.3 沉默LRP 6對(duì)細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染siRNA-LRP6后，細(xì)胞在 24、48、72 h的OD值均低于siRNA-control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 沉默LRP 6后不同時(shí)間點(diǎn) A549細(xì)胞OD值的比較（ n= 3，±s）

表2 沉默LRP 6后不同時(shí)間點(diǎn) A549細(xì)胞OD值的比較（ n= 3，±s）

組別siRNA-control組siRNA-LRP6組t值P值24 h 0.58±0.04 0.41±0.03 7.141 0.002 48 h 1.08±0.16 0.78±0.09 2.831 0.047 72 h 1.63±0.21 0.93±0.11 5.114 0.007

2.4 沉默LRP 6對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響

結(jié)晶紫染色后發(fā)現(xiàn)，siRNA-LRP6組細(xì)胞的克隆形成數(shù)目為（56±13）個(gè)，低于siRNA-control組的（119±24）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.998，P=0.016）。

2.5 沉默LRP 6對(duì)FGF 8信號(hào)的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-LRP6組A549細(xì)胞中FGF8及增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、LRP6的表達(dá)水平均明顯低于siRNA-control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

表3 A549細(xì)胞中FGF 8、Cyclin D 1及LRP 6蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（ n= 3，±s）

表3 A549細(xì)胞中FGF 8、Cyclin D 1及LRP 6蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（ n= 3，±s）

組別siRNA-control組siRNA-LRP6組t值P值FGF8 1.12±0.13 0.33±0.06 9.557 0.001 Cyclin D1 2.64±0.21 1.02±0.12 11.601 0.000 LRP6 1.86±0.22 0.26±0.03 12.481 0.000

3 討論

肺癌是世界上發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，主要包括兩種類型，分別是小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[12]。SCLC占所有肺癌的15%～20%，其更具侵略性，通常在早期已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移[13]；而NSCLC占所有肺癌的80%～85%，并可進(jìn)一步分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和各種混合型癌，大多數(shù)NSCLC患者被診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期，僅有約11個(gè)月的中位生存期[14-15]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，Wnt途徑是維持肺動(dòng)態(tài)平衡的主要信號(hào)途徑之一，其異常激活可能與多種衰弱性肺疾病有關(guān)[12]。類似于其他惡性腫瘤，Wnt信號(hào)在肺癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。以往研究表明，LRP6參與了腫瘤細(xì)胞的調(diào)控，在口腔癌中，LRP6是一個(gè)潛在的預(yù)測(cè)靶標(biāo)[10]。此外，LRP6也可通過(guò)改變?chǔ)?catenin亞細(xì)胞的分布來(lái)促進(jìn)人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞的增殖[16]。有研究已證實(shí)，LRP6是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要共激活因子，LRP6可與Wnt配體結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]，其機(jī)制是LRP6可募集axin至細(xì)胞膜上，進(jìn)而增加β-catenin的穩(wěn)定性，并促進(jìn)其核易位，通過(guò)與LEF-1/TCF轉(zhuǎn)錄因子作用，從而促進(jìn)Wnt/β-catenin通路下游基因轉(zhuǎn)錄[19]。有研究顯示，臨床樣本中，F(xiàn)GF8高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，并預(yù)示著某些惡性腫瘤（包括前列腺癌和乳腺癌）預(yù)后較差[12]。LRP6是Wnt/β-catenin通路的重要共激活因子，而Wnt/β-catenin 通路又可調(diào)節(jié) FGF8的表達(dá)[10]，猜測(cè)在肺癌中，LRP6也可能通過(guò)FGF8信號(hào)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

在口腔癌細(xì)胞中，LRP6是Wnt/β-catenin通路的重要共激活因子，而Wnt/β-catenin通路也可調(diào)控FGF8的表達(dá)，F(xiàn)GF8是Wnt通路的下游基因[10]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF8在正常成人組織中表達(dá)較低，但在胚胎發(fā)育期間及包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌在內(nèi)的幾種激素惡性腫瘤中廣泛表達(dá)，F(xiàn)GF8可在胚胎發(fā)育過(guò)程中介導(dǎo)胚胎上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，進(jìn)而參與原腸胚形成、早期分化和腦、四肢和腎臟的形成[20-21]。在細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中，F(xiàn)GF8能夠促進(jìn)乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌腫瘤的發(fā)生，其可通過(guò)自分泌和旁分泌循環(huán)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和血管的生成，賦予多種腫瘤細(xì)胞惡性表型[22]。FGF-8可以增強(qiáng)體外前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并促進(jìn)體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移[23]；在小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FGF8可誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial interstitial transformation，EMT）和貼壁自主生長(zhǎng)，并加速體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[24]。然而，F(xiàn)GF8在肺癌中的作用機(jī)制仍未完全闡明，猜測(cè)在肺癌中，LRP6也可能通過(guò)FGF8信號(hào)發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，LRP6在正常肺細(xì)胞CCD-19Lu中呈低表達(dá)，而在肺癌細(xì)胞株中普遍呈高表達(dá)；且沉默LRP6可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，作用機(jī)制可能與FGF8信號(hào)及其下游增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究首次報(bào)道了LRP6通過(guò)調(diào)節(jié)FGF8信號(hào)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響，LRP6可能是診斷治療肺癌的潛在分子靶標(biāo)。

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CACancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Deng D,Zhang Y,Bao W,et al.Low-density lipoprotein receptor-related protein 6(lrp6)rs10845498 polymorphism is associated with a decreased risk of non-small cell lung cancer[J].Ⅰnt J Med Sci,2014,11(7):685.

[3]Pacheco-Pinedo EC,Durham AC,Stewart KM,et al.Wnt/?2-catenin signaling accelerates mouse lung tumorigenesis by imposing an embryonic distal progenitor phenotype on lung epithelium[J].J ClinⅠnvest,2011,121(5):1935-1945.

[4]左慧敏,曾林祥.Wnt信號(hào)通路與非小細(xì)胞肺癌的研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,35(2):266-269.

[5]Macdonald BT,Tamai K,He X.Wnt/beta-catenin signaling:components,mechanisms,and diseases[J].Dev Cell,2009,17(1):9-26.

[6]林翠鴻,柯蒙,黃品芳,等.LRP6受體胞內(nèi)區(qū)賴氨酸位點(diǎn)突變和經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)性分析[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2015,35(16):1461-1464.

[7]Lee JS,Hur MW,Lee SK,et al.A novel slrp6e1e2 inhibits canonical wnt signaling,epithelial-to-mesenchymal transition,and induces mitochondria-dependent apoptosis in lung cancer[J].PLoS One,2012,7(5):e36520.

[8]Matsunaga E,Katahira T,Nakamura H.Role of Lmx1b and Wnt1 in mesencephalon and metencephalon development[J].Development,2002,129(22):5269-5277.

[9]Canning CA,Lee L,Ⅰrving C,et al.Sustained interactive Wnt and FGF signaling is required to maintain isthmic identity[J].Dev Bio,2007,305(1):276-286.

[10]Yuan Y,Xie X,Jiang Y,et al.LRP6 is identified as a potential prognostic marker for oral squamous cell carcinoma via MALDⅠ-ⅠMS[J].Cell Death Dis,2017,8(9):e3035.

[11]Yao Y,Hou X,Hui F,et al.Proteomic identification of cyclophilin A as a potential biomarker and therapeutic target in oral submucous fibrosis[J].Oncotarget,2016,7(37):60348-60365.

[12]Rapp J,Jaromi L,Kvell K,et al.WNT signaling-lung cancer is no exception[J].Respir Res,2017,18(1):167.

[13]Molina JR,Yang P,Cassivi SD,et al.Non-small cell lung cancer:epidemiology,risk factors,treatment,and survivorship[J].Mayo Clin Proc,2008,83(5):584-594.

[14]D’Addario G,Früh M,Reck M,et al.Metastatic nonsmall-cell lung cancer:ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis,treatment and follow-up[J].Ann Oncol,2010,21 Suppl 5:v116.

[15]劉新,沈世林,王玉萍,等.中晚期非小細(xì)胞肺癌的綜合介入治療現(xiàn)狀[J].中華肺部疾病雜志(電子版),2017,10(4):486-489.

[16]Li Y,Lu W,He X,et al.LRP6 expression promotes cancer cell proliferation and tumorigenesis by altering betacatenin subcellular distribution[J].Oncogene,2004,23(56):9129-9135.

[17]Bryja V,Andersson ER,Schambony A,et al.The extracellular domain of Lrp5/6 inhibits noncanonical Wnt signaling in vivo[J].Mol Biol Cell,2009,20(3):924-936.

[18]Lu W,Liu CC,Thottassery JV,et al.Mesd is a universal inhibitor of Wnt coreceptors LRP5 and LRP6 and blocks Wnt/beta-catenin signaling in cancer cells[J].Biochemistry,2010,49(22):4635-4643.

[19]He X,Semenov M,Tamai K,et al.LDL receptor-related proteins 5 and 6 in Wnt/beta-catenin signaling:arrows point the way[J].Dev,2004,131(8):1663.

[20]Mattila MM,H?rk?nen PL.Role of fibroblast growth factor 8 in growth and progression of hormonal cancer[J].Cytokine Growth Factor Rev,2007,18(3-4):257-266.

[21]劉皓,姜建萍,張娟娟,等.FGF8輔助牙源性上皮誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓細(xì)胞[J].中國(guó)病理生理雜志,2017,33(4):730-734.

[22]Tuomela J,Gr?nroos TJ,Valta MP,et al.Fast growth associated with aberrant vasculature and hypoxia in fibroblast growth factor 8b(FGF8b)over-expressing PC-3 prostate tumour xenografts[J].BMC Cancer,2010,10:596.

[23]Valta MP,Tuomela J,Bjartell A,et al.FGF-8 is involved in bone metastasis of prostate cancer[J].Ⅰnt J Cancer,2008,123(1):22-31.

[24]Song Z,Powell WC,Kasahara N,et al.The effect of fibroblast growth factor 8,isoform b,on the biology of prostate carcinoma cells and their interaction with stromal cells[J].Cancer Res,2000,60(23):6730-6736.