黃燕，蔣鷗#，文慶蓮，劉宇，林盛，何玉，吳敬波，孟凡智，馬成

1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤科，四川瀘州646000

2西南醫(yī)科大學附屬內江市第二人民醫(yī)院腫瘤中心，四川內江641100

腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）即腫瘤微環(huán)境內聚集著大量的巨噬細胞。TAM可以粗略地分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有吞噬、清除異物及抗腫瘤的作用，而M2型巨噬細胞主要發(fā)揮免疫抑制的功能，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤具有促進作用[1]。外周單核細胞在腫瘤細胞分泌的催化因子的作用下，遷移至腫瘤微環(huán)境中，并分化成M2型巨噬細胞[2]，M2型巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中主要的炎性細胞成分。M2型巨噬細胞的特點為高表達甘露糖受體，而其他細胞一般不表達或呈低表達[3]。研究發(fā)現(xiàn)，采用抗甘露糖受體的單克隆抗體封閉M2型巨噬細胞表達的甘露糖受體后，能夠加強腫瘤的抗原呈遞作用，強化腫瘤免疫應答[4]；同時可以減少病灶的淋巴結轉移[5]。由此推斷，M2型巨噬細胞表面的甘露糖受體可作為腫瘤靶向治療的靶點[6]。本研究通過縮合反應將甘露糖基接枝于殼聚糖上，利用殼聚糖與依替膦酸之間發(fā)生的離子交聯(lián)反應，構建納米粒。觀察納米粒與多種細胞，尤其是M2型巨噬細胞的結合能力，為后期的基礎實驗提供依據，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）、羥甲基殼聚糖（carboxymethyl chitin，CMC）、1（-3-二甲氨基丙基）-3乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-Ethyl-3（-3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC]、佛 波 酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）、N-羥基丁二酰亞胺（N-Hydroxy succinimide，NHS）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomerⅠ，F(xiàn)ⅠTC）均購自美國Sigma公司；Bruker超導脈沖傅立葉變換核磁共振波譜儀購自瑞士Bruker公司；依替膦酸二鈉購自南京森貝伽生物科技有限公司；電鏡購自荷蘭SEⅠ公司；U937細胞由四川大學華西科技園提供；γ-干擾素（interferon-γ，ⅠFN-γ）、白細胞介素-4（interleukin-4，ⅠL-4）和白細胞介素-13（interleukin-13，ⅠL-13）均購自上海拜力生物科技有限公司；SW620人結腸癌細胞和A549人肺癌細胞均由西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤學實驗室提供；成纖維細胞由西南交通大學生物材料學與分子實驗室提供；細胞膜紅色熒光探針（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiⅠ）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；Bx-51熒光顯微鏡購自奧林巴斯公司；熒光酶標儀購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 研究方法

1.2.1 合成甘露糖化殼聚糖 參考相關文獻的方法合成甘露糖化殼聚糖[7]，并對方法進行了一定的改良。取MES 6 g溶于300 ml的蒸餾水，應用氫氧化鈉調整PH值為5.2，配置濃度為20 mg/ml的MES溶液；分別取CMC和對氨基苯酚甘露糖100 mg溶解于100 ml的MES溶液，攪拌至清澈透明液體；再將704 mg的EDC及70 mg的NHS加入到上述液體中混合攪拌，30℃攪拌至液體干涸；將50 ml的MES溶液加入干涸合成物，室溫攪拌至完全溶解，利用濾紙及過濾器過濾產物，清洗沉淀3次，收集液體加入截留分子量為800的透析袋中，清水透析7 d清除小分子物質；將所得液體冷凍干燥，得到產物甘露糖化殼聚糖。

對氨基苯酚甘露糖的苯環(huán)上有4個處于對稱位置的氫，在核磁共振氫譜的δ=7.5～7.6 ppm處出現(xiàn)波峰，而羧甲基殼聚糖的氫均在5 ppm以下。采用Bruker超導脈沖傅立葉變換核磁共振波譜儀檢測反應物的氫譜圖，判斷甘露糖是否成功接枝在殼聚糖上。

1.2.2 構建納米粒 將上述產物溶于蒸餾水，配置成甘露糖化殼聚糖溶液，濃度為4 mg/ml，攪拌至清澈透明液體，調整PH值為6；取依替膦酸二鈉溶于蒸餾水中，調整PH值為6，配置成依替膦酸二鈉溶液，濃度為2 mg/ml。將依替膦酸溶液逐滴滴加于甘露糖化殼聚糖溶液中，室溫攪拌15 min，得到納米產物。

將上述產物放入透析袋（截留分子量為800）中，于清水透析24 h，透析后所得的溶液再進行冷凍干燥2 d。產物即為甘露糖修飾殼聚糖與依替膦酸復合物納米粒（mannose modified chitosan and etidronic acid complex nanoparticlesmannose modified chitosan and etidronic acid complex nanoparticles，MCMC）。電鏡下直接觀察納米粒的形態(tài)及粒徑。

1.2.3 制作體外細胞攝取納米粒的模型 取對數期生長期的U937細胞5×105/ml加入6孔板中，每孔2 ml，每孔加入佛波酯200 ng/ml，誘導6 h后，誘導成巨噬細胞（稱M0型巨噬細胞），再加入LPS（100 ng/ml）及 ⅠFN-γ（20 ng/ml）繼續(xù)誘導 66 h（共72 h），向M1型巨噬細胞方向誘導；U937細胞用佛波酯200 ng/ml誘導6 h后再加入20 ng/ml的ⅠL-4及20 ng/ml的ⅠL-13，繼續(xù)誘導66 h（共72 h），向M2型巨噬細胞方向誘導。

將誘導的M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞、SW620人結腸癌細胞和A549人肺癌細胞和成纖維細胞分別接種至6孔培養(yǎng)板中，細胞數為1×106/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數生長期后，每組均加入納米粒（每100 μl細胞懸液加入20 ng）培育3 h。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察細胞攝取納米粒情況MCMC配置成濃度為1 mg/ml的懸浮液，攪拌均勻后加入FⅠTC熒光劑，質量比為1∶50，在避光的條件下室溫攪拌4～6 h。將攪拌完成后的顆粒懸浮液在清水中透析2～3 d（全程避光）。透析完成后即得到標記成功的顆粒，肉眼可見綠色。FTⅠC激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長為519 nm，細胞如果吞噬納米粒，在胞質內可呈現(xiàn)綠色熒光。

細胞膜紅色熒光染料DiⅠ可將細胞膜染為紅色（激發(fā)波長為549 nm，發(fā)射波長為565 nm），可區(qū)別于FⅠTC對納米顆粒的綠色熒光。每個培養(yǎng)板加入DiⅠ，培養(yǎng)3 min，用培養(yǎng)基洗滌染色介質2次。將各組貼壁細胞刮離、收集后封片，在Bx-51熒光顯微鏡下先于同一視野內調整至DiⅠ染劑激發(fā)波，使細胞膜呈現(xiàn)橙紅色熒光，再調整激發(fā)波長為495 nm，使納米顆粒的綠色熒光顯現(xiàn)。然后將兩張圖片經計算機軟件進行圖像融合后觀察同一視野內細胞攝取納米顆粒能力的情況。

1.2.5 測定各組細胞攝取納米粒的量 按1.2.3的步驟培養(yǎng)細胞，收集各組培養(yǎng)板細胞，每組設置3個復孔，實驗重復3次。收集每組中培養(yǎng)板復孔的細胞，棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌貼壁細胞3次，用1 ml的PBS混勻細胞，分別加入96孔板各孔中，各組細胞用未加納米粒的同種細胞作為對照，使用熒光酶標儀檢測激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為538 nm的FⅠTC的熒光強度，熒光酶標儀檢測的結果以相對熒光值（relative fluorescence unit，RFU）表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件-對數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，5種細胞攝取納米粒的RFU之間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 納米顆粒合成結果檢測

通過電鏡觀察納米顆粒，呈圓形或類圓形，大小約為100 nm，詳見圖1。通過600 MHz核磁共振氫譜檢測發(fā)現(xiàn)，在7.56 ppm處出現(xiàn)了明顯的波峰，表明殼聚糖成功接枝于甘露糖。

2.2 各種細胞對納米顆粒的攝取情況

圖1 8萬倍電鏡下的納米顆粒

DiⅠ未與細胞膜脂質雙分子層結合前不發(fā)光，結合后呈現(xiàn)紅色熒光，可標記細胞膜，而FⅠTC可與納米藥物MCMC結合后發(fā)黃綠色熒光，因此，在熒光顯微鏡下能夠清晰地顯示MCMC與細胞的關系。如圖2所示，M1型巨噬細胞的紅色熒光對應處未觀察到綠色熒光出現(xiàn)，說明M1型巨噬細胞對MCMC未見肉眼可分辨的吞噬；其他3種細胞的情況與M1型巨噬細胞類似。M2型巨噬細胞因大量吞噬了納米顆粒，顯示明亮的綠色熒光，綠色熒光與紅色熒光所表明的細胞位置一一對應，并且圖像融合后熒光顏色明顯變化。（圖2）

2.3 納米顆粒在各種細胞中的RFU值

采用熒光酶標儀檢測M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞、人結腸癌細胞SW620、人肺癌細胞A549和成纖維細胞這5種細胞的RFU值，分別為（3.59±0.23）、（18.80±0.47）、（3.45±0.05）、（3.39±0.17）和（3.41±0.29）。單因素方差分析結果顯示，5種細胞的RFU值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=13606.0，P＜0.01），其中，M2型巨噬細胞的RFU值最高，而其他細胞之間的RFU值相近。

3 討論

圖2 5種細胞對納米粒的攝取情況

惡性腫瘤常常伴有炎性浸潤，與腫瘤的發(fā)展有著密切的關系[8]。M2型巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的主要炎性細胞[9]。M2型巨噬細胞分泌血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和趨化因子CXCL8等多種細胞因子促進腫瘤細胞的增殖和浸潤[10]。另外，M2型巨噬細胞高表達 ⅠL-10，低表達 ⅠL-12，以及轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和趨化因子表達CCL22（CC chemokines 22，CCL22）上調，驅動腫瘤病灶內的免疫抑制微環(huán)境的形成[11]，說明了M2型巨噬細胞具有免疫調節(jié)的作用，可通過調節(jié)免疫應答和免疫逃逸促進腫瘤的進展。M2型巨噬細胞還參與調節(jié)自身微環(huán)境的代謝，與干細胞相互作用，促進腫瘤的發(fā)展[12-14]。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞可以影響化療效果以及腫瘤的復發(fā)。M2型巨噬細胞在腫瘤的進展中發(fā)揮著重大的推動作用。目前已經有以M2型巨噬細胞作為靶點的抗腫瘤研究[16]，所以通過靶向作用M2型巨噬細胞，阻止腫瘤的進展，是一種可能的抗腫瘤途徑。

本研究顯示，該納米粒對M2型巨噬細胞具有明顯的靶向性結合能力，而對成纖維細胞無此作用，說明納米粒對正常細胞的影響較?。籑2型巨噬細胞高表達的甘露糖受體能夠與甘露糖高效結合，制備的納米粒攜帶甘露糖殘基，因此，靶向性結合應該源于這種配體與受體的特異性結合。M1型巨噬細胞本身具有吞噬異物的能力，但在本研究中未觀察到M1型巨噬細胞的熒光強度明顯高于成纖維細胞、人結腸癌細胞SW620和人肺癌細胞A549，可能與共孵育的時間較短有關。本研究通過依替膦酸與殼聚糖構建納米顆粒，主要在酸性環(huán)境下，利用依替膦酸帶負電荷的羧基與殼聚糖帶正電荷的氨基，通過離子交聯(lián)反應形成納米顆粒，通過調節(jié)反應條件可形成不同大小或直徑的納米顆粒。依替膦酸屬于雙磷酸鹽，其抗骨轉移作用被廣泛運用，體外數據已經證實雙磷酸鹽對乳腺癌、肺癌、腎癌等實體腫瘤細胞具有一定的抗腫瘤作用[17-20]，但其在骨以外的組織濃度極低，血漿半衰期短，不能達到有效血藥濃度，因此在實體瘤的治療上難以發(fā)揮療效。將依替膦酸作為納米粒的組成部分，有望解決依替膦酸半衰期過短的缺點，為進一步進行體內試驗奠定實驗基礎。納米粒中的雙磷酸鹽可以在腫瘤病灶內及周圍釋放達到較高的藥物濃度，從而發(fā)揮其抗腫瘤的效應，這種推測需要后期通過基礎實驗進一步驗證。

另外，納米粒直徑可影響其到達腫瘤組織的納米粒濃度，所以納米粒直徑的選擇顯得尤為重要。腎小球內皮細胞間隙在40～60 nm，制備的納米粒過小則會被過濾；而肝脾血竇的血管內皮細胞間隙為200～500 nm，納米粒過大則會被截留，導致Kupffer細胞被吞噬；因此，通過調整實驗條件，制備直徑為100 nm左右的納米粒，以便得到半衰期較長的納米藥物，方便后續(xù)的動物實驗使用。

本研究證實了經甘露糖修飾的殼聚糖構建納米顆粒能夠靶向結合M2型巨噬細胞，由于M2型巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的主要炎性細胞，因此，本實驗制備的納米粒藥物為進一步探討靶向腫瘤微環(huán)境，從而開展抗腫瘤的研究奠定了實驗基礎。

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