萬倩，鄧野，李弦，王丹，楊繼元#

1長江大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，湖北 荊州434000

2荊州市第一人民醫(yī)院中心實驗室，湖北 荊州434000

胃癌是常見的惡性腫瘤，在中國發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位[1]。中國胃癌防治的現(xiàn)狀是“一高三低”：發(fā)病、病死率高，早期診斷率低，手術根治率低，5年生存率低。盡管近年來胃癌的病死率有所下降，但仍嚴重威脅著人類的生命健康。中國胃癌患者往往因非特異性的消化道癥狀導致早期就診率低，大多數(shù)患者確診時已是晚期，錯過最佳手術時機，因此在基因層面研究在胃癌發(fā)生、發(fā)展、增殖中起調(diào)控作用的基因是必要的。zeste基因增強子同源物 2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是PcG基因家族中PRC2復合物的催化活性亞單位，與果蠅基因同源，它定位于人染色體7q35位置上[2]，通過催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27m3）參與表觀遺傳學和基因表達的調(diào)控[3]。多項研究顯示，EZH2基因在許多腫瘤中都存在著過表達，并與腫瘤的生物學行為有關，如胃癌[4]、乳腺癌[5]等。這使其可能成為一個重要的早期診斷、評價預后的分子指標，更有可能成為腫瘤的靶向治療的新靶點。本研究以靶向干擾下調(diào)EZH2基因的表達后，觀察EZH2基因對胃癌細胞發(fā)生、發(fā)展、增殖調(diào)控的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SGC7901細胞、RPMⅠ1640培養(yǎng)基、含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清購自四季青公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）由荊州市第一人民醫(yī)院中心實驗室保存；Lipo6000TM轉染試劑、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、RⅠPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8試劑盒、焦碳酸乙二酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）、Tween-20、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、Beyo ECLPlus化學發(fā)光檢測試劑、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、Tris-HCL、過硫酸銨（ammonium persulfate，AP）、苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF）、30%Acr-Bis、RNAeasy?動物總RNA抽提試劑盒（離心柱式）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、BeyoFast SYBR Green qPCR Mix、cDNA第一鏈合成試劑盒、蛋白分子量標準品、增強型CCK-8試劑盒均購自碧云天生物技術公司；三羥甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、甘氨酸、異丙醇購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；EZH2siRNA、EZH2引物、GAPDH引物均由百奧邁科生物技術公司合成，詳見表1；兔抗人EZH2多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔多克隆抗體購自美國GeneTex公司，兔抗β-actin多克隆抗體、抗體稀釋液購自武漢安特捷生物技術有限公司。

表1 EZH 2干擾RNA序列片段

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將SGC7901細胞接種在有RPMⅠ1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，倒置顯微鏡下觀察細胞呈致密單層后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞轉染 根據(jù)Genebank提供的EZH2基因序列（ⅠD：2146），使用在線設計軟件，通過基因序列比對，合成3條特異性EZH2siRNA。取對數(shù)生長期胃癌SGC7901細胞，以每孔1×105個接種于六孔板中，當細胞匯合率達到55%～65%時按照Lipo6000TM轉染試劑說明書進行轉染步驟對上述3對EZH2siRNA片段（EZH2siRNA-1、EZH2siRNA-2、EZH2siRNA-3）進行轉染，同時設立陰性對照組（轉染非特異性siRNA片段）和空白對照組（不轉染siRNA片段）。每孔siRNA為100 pmol，Lipo6000TM轉染試劑用量為5 μl，轉染后置入培養(yǎng)箱，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h后收集細胞。

1.2.3 細胞總RNA的抽提及qRT-PCR檢測 將轉染后48 h的各組細胞按照RNA抽提試劑盒和逆轉錄試劑盒說明書進行RNA的抽提和逆轉錄。紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度（OD260/OD280），置于-80℃冰箱保存。將總RNA逆轉錄為cDNA，以各組cDNA為模板對EZH2基因和內(nèi)參GAPDH進行實時熒光定量PCR反應，優(yōu)化實時定量多聚酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）反應體系及條件，qRT-PCR反應體 系 為 20 μl，其 中 Beyo Fast SYBR Green qPCR Mix 10 μl、上下游引物各 0.5 μl、模板 2 μl、滅菌水7.2 μl，反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 15 s，56℃15 s，72℃15 s，40個循環(huán)擴增后進行高分辨溶解曲線，每組設3個復孔。EZH2引物序列上游：5'-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3'，下 游 ：5'-TGTGTTGGAAAATCCAAGTCA-3'。GAPDH上游：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。實驗結果采用 2-△△Ct法計算各組EZH2mRNA表達水平的相對值，選取干擾效果最好的EZH2siRNA片段進行后續(xù)實驗。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 取EZH2siRNA組、陰性對照組和空白對照組共3種細胞，將細胞用RⅠPA裂解液和PMSF處理，冰上孵育30 min，4℃12 000 rpm離心15 min，得上清蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。根據(jù)蛋白大小灌制10%分離膠和5%濃縮膠，每泳道上樣20 μl，電泳后濕轉法至PVDF膜，根據(jù)蛋白大小將膜剪開，用含5%脫脂奶粉的TBST液（封閉液）封閉PVDF膜，室溫搖床封閉1 h后，將PVDF膜浸在一抗兔抗人EZH2多克隆抗體（1∶1000）中4℃孵育過夜，對照孵育一抗兔抗β-actin多克隆抗體（1∶5000），TBST 洗滌PVDF膜3次，每次10 min，再將PVDF膜浸在用封閉液稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗（1∶5000）中，室溫搖床孵育1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，通過增強型化學熒光顯色（enhanced chemiluminescence，ECL）法進行顯影。

1.2.5 CCK- 8法檢測細胞增殖能力 將傳代4～6代的細胞用0.25%胰蛋白酶消化后計數(shù)，按每孔加入100 μl 2000個細胞的濃度接種96孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。更新培養(yǎng)基后培養(yǎng)2 h，設置空白對照組（有細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液而無細胞）、陰性對照組（有細胞和CCK-8溶液而未轉染混合物）、siRNA組（有細胞、CCK-8溶液及轉染混合物），每組設3個復孔，分別于轉染后24、48、72、96 h每孔加入CCK-8溶液10 μl，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度OD值。每組細胞測3個孔，取平均值，繪制細胞生長曲線。所有實驗均重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)-計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染后EZH 2 mRNA的表達水平

胃癌細胞SGC7901轉染EZH2siRNA后，經(jīng)實時熒光定量PCR儀檢測EZH2mRNA的表達，結果顯示，以空白對照組為內(nèi)參，siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組EZH2mRNA的相對表達量分別為（0.41±0.19）、（0.22±0.15）、（0.47±0.28），均低于陰性對照組的（1.11±0.38），差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.008、0.002、0.011），其中siRNA-2組EZH2mRNA相對表達量最低，即EZH2siRNA-2組干擾效果最強，用于后續(xù)實驗。陰性對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.458）。（圖1）

圖1 各組胃癌SGC7901細胞轉染siRNA后EZH 2 mRNA的相對表達量

2.2 轉染后EZH 2蛋白表達水平

SGC7901胃癌細胞轉染最佳干擾RNA片段后，經(jīng)Western blot法檢測EZH2蛋白相對表達量，結果顯示，空白對照組、陰性對照組和siRNA干擾組的EZH2蛋白相對表達量分別為（0.362±0.026）、（0.398±0.036）、（0.036±0.017），3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=157.745，P＜0.01）。（圖2）

圖2 胃癌SGC7901細胞轉染后EZH 2蛋白表達水平

2.3 下調(diào)EZH 2基因對胃癌細胞SGC7901增殖的影響

采用CCK-8法檢測下調(diào)EZH2表達后SGC7901細胞的增殖能力。相比于空白對照組和陰性對照組，siRNA組SGC7901細胞的增殖能力減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2、圖3）

表2 SGC7901細胞轉染siRNA后隨時間變化的細胞增殖力（OD450，±s）

表2 SGC7901細胞轉染siRNA后隨時間變化的細胞增殖力（OD450，±s）

組別空白對照組陰性對照組siRNA組24 h 0.22±0.13 0.25±0.15 0.18±0.08 48 h 0.39±0.19 0.35±0.13 0.20±0.09 72 h 0.42±0.23 0.40±0.26 0.21±0.14 96 h 0.65±0.32 0.63±0.35 0.39±0.14

圖3 SGC7901細胞轉染EZH 2 siRNA后的細胞增殖能力

3 討論

胃癌進展是多因素、多階段及多基因變異的綜合病變過程，主要是由端粒酶激活、抑癌基因失活和癌基因激活等引發(fā)[6]。Chen等[7]研究顯示胃癌組織中的EZH2陽性表達率為56.6%，且與腫瘤體積、浸潤層次、淋巴結轉移、血行轉移及臨床惡性程度呈正相關，表明EZH2基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。另外，He等[8]對117例胃癌組織及其相應的正常組織中EZH2蛋白的水平進行了分析，結果顯示：在70.1%的胃癌組織中，EZH2的表達陽性，而正常的胃黏膜上皮細胞中，只有5.4%是EZH2表達陽性，且EZH2高表達患者的平均總生存期（25.2個月）和無病生存期（20.2個月）均短于EZH2低表達的患者（40.5、35.9個月）。該結果說明EZH2可作為胃癌患者預后效果的預測和評估指標。

有研究表明，EZH2表達下調(diào)抑制細胞增殖是通過Wnt/β-catenin通路來實現(xiàn)的，在人腎癌ACHN細胞中下調(diào)EZH2基因表達抑制細胞增殖和侵襲的同時Wnt3a和β-catenin蛋白的表達也下調(diào)，相反Wnt/β-catenin通路阻滯藥糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表達會顯著提高[9]，但在胃癌中的研究甚少。

本研究著重從細胞層面探討了EZH2對胃癌細胞系SGC7901的細胞增殖調(diào)控作用。通過對細胞進行siRNA轉染，以實現(xiàn)對細胞的EZH2基因沉默，并通過熒光定量PCR以及蛋白質(zhì)印跡實驗，證實了EZH2的基因下調(diào)。在此基礎上，siRNA組的SGC7901細胞，其增殖能力較對照組下降，這也與以往的研究結果一致[9-12]。上述實驗證據(jù)說明，EZH2的基因下調(diào)抑制了SGC7901胃癌細胞系的細胞增殖，EZH2基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要意義，為胃癌基因治療提供一定的理論基礎，但其作用通路及機制還有待進一步研究。

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