黃聲凱，王佳，李燕，李淵，林虹，李東東，崔嬋娟，王國婧，趙玫，黃常志#

國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院1檢驗科，3病因室/分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室/癌發(fā)生及預(yù)防分子機理北京市重點實驗室，北京100021

2煤炭總醫(yī)院檢驗科，北京100028

泛素-蛋白酶體降解途徑異常會導(dǎo)致人體發(fā)生多種疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、病毒感染性疾病以及癌癥等[1]。癌細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能夠促進細胞的存活和增殖，或抑制細胞的凋亡，這為泛素蛋白酶體系統(tǒng)抑制藥的臨床試驗奠定了基礎(chǔ)，泛素蛋白酶體系統(tǒng)抑制藥就是將這種細胞調(diào)控平衡轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎劳鯷2]。大量關(guān)于蛋白酶體抑制藥的臨床試驗已經(jīng)處于二期或三期研究階段[3-6]，相信在不遠的將來會有更多相應(yīng)的藥物被開發(fā)。泛醌蛋白（ubiquilin，UBQLN）包括 ubiquilin 1、ubiquilin 2和ubiquilin 4，屬于泛素類蛋白家族，是泛素蛋白酶體降解過程中的主要調(diào)控因子。UBQLN最廣泛的功能是調(diào)控泛素蛋白降解系統(tǒng)，其通過一個C端泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（ubiquitin associated domain，UBA）識別與結(jié)合多泛素化的底物蛋白，并通過一個N端泛素樣結(jié)構(gòu)域（ubiquitin like domain，UBL）將它們傳遞給蛋白酶體系統(tǒng)[7]。目前，已有關(guān)于UBQLN在自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解過程中的相關(guān)報道[8-10]。UBQLN被描述為適配器樣蛋白，其作用是將泛素化底物轉(zhuǎn)運至蛋白酶體[11-12]。其中，UBQLN4隸屬于UBQLN家族[13]，編碼ubiquilin 4蛋白。其中，ubiquilin 4包含4個重復(fù)的可壓力介導(dǎo)的熱休克伴侶蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（stress-inducible protein-1_heat shock chaperonin-binding，STⅠ1_HS-bd），已有研究證明，前端的兩個STⅠ1可結(jié)合含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號的序列蛋白，ubiquilin 4由疏水結(jié)構(gòu)域通過疏水作用連接這些蛋白，并將其連接于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。UBL連接19S蛋白酶體的S5a亞基，UBA結(jié)合多泛素化的底物蛋白，并開始進行蛋白酶體降解，ubiquilin 4在蛋白的泛素化降解方面具有重要的作用[12,14-15]。為進一步研究ubiquilin 4在細胞內(nèi)的生物學(xué)功能，闡明ubiquilin 4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用，本研究將ubiquilin 4在原核細胞中進行表達，通過谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）標(biāo)簽進行純化，并在MKN45細胞中通過免疫共沉淀法及蛋白質(zhì)譜鑒定法尋找與ubiquilin 4相互作用的蛋白，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM/高糖培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）均購自美國HyClone公司；轉(zhuǎn)染試劑HPXtreme購自瑞士Roche公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、考馬斯亮藍G250、硫酸銨、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，ⅠPTG）和 4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPⅠ）均購自美國 Sigma公司；谷胱甘肽瓊脂糖凝膠、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱均購自美國ThermoFisher公司；正置熒光顯微鏡購自德國Leica公司；抗泛醌蛋白4（anti-ubiquilin 4，克隆號為A333）鼠抗人抗體購自美國Santa Cruz公司；標(biāo)簽抗體MYC和FLAG購自美國Sigma公司；Alexa Fluor 594熒光標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基中，加入100 μg/ml的青鏈霉素混合液（雙抗）。于含5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔24～48 h更換培養(yǎng)基，并觀察細胞狀態(tài)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天，將細胞接種至6孔板中，調(diào)整細胞密度至轉(zhuǎn)染時的80%～90%。經(jīng)15～20 h后細胞貼壁牢固，為細胞更換新鮮的全血清培養(yǎng)基。待轉(zhuǎn)染的質(zhì)?；靹蚝?，將2 μg質(zhì)粒加入200 μl的無血清培養(yǎng)基中，混勻。再將混勻的4 μl HP-Xtreme轉(zhuǎn)染試劑加入上述體系，混勻后，室溫靜置15 min后逐滴加入6孔板中，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 細胞免疫熒光染色

細胞爬片生長至30%～70%的密度，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，2%～4%的甲醛室溫固定細胞15 min，PBS洗滌，0.5%的Triton X-100通透細胞15 min，PBS洗滌。1%的BSA室溫封閉30 min。Anti-ubiquilin 4一抗4℃孵育過夜，PBS洗滌。加入封閉液稀釋好的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗滌。加入DAPⅠ染液，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌。70%的甘油（采用PBS配制）封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化

10 ng質(zhì)粒加入100 μl感受態(tài)中，輕彈管壁混勻，放于冰上15～30 min。于42℃的水浴中準(zhǔn)確熱激90 s，然后迅速放置冰上。5 min后，向管中加入等體積的無抗生素的液體LB（luria-bertani）培養(yǎng)基，室溫37℃下220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，3000 r/min離心5 min，去掉培養(yǎng)基，菌體全部涂布于加了相應(yīng)抗生素的LB平板中。

1.6 GST-pull down實驗

將轉(zhuǎn)化后的BL21菌液搖到光密度（optical density，OD）600為0.6后，加入終濃度為0.2 mmol/L的ⅠPTG，30℃下誘導(dǎo)6 h，超聲破碎后加入Glutathione Agarose純化。純化的GST融合蛋白GST-ubiquilin 4與MKN45細胞裂解液于4℃下孵育過夜，各個樣本中加入1.5×蛋白上樣緩沖液30 μl，沸水煮浴蛋白質(zhì)樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.7 考馬斯亮藍染色

SDS-PAGE膠經(jīng)40%甲醇與10%乙酸固定30min，去離子水洗滌15 min，共洗滌4次；0.12%考馬斯亮藍、10%亞硫酸氨、10%磷酸和20%甲醇染色6 h，去離子水過夜脫色至背景清楚。

1.8 蛋白質(zhì)譜鑒定

蛋白質(zhì)譜鑒定及肽段分析由清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心完成。

1.9 免疫共沉淀

MYC-MYH9和FLAG-UBQLN4共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，加入細胞裂解液CF0.15（羥乙基哌嗪乙硫磺酸30 mmol/L、氯化鈉150 mmol/L，氯化鎂1.5 mmol/L、氯化鉀10 mmol/L、0.5%乙基苯基聚乙二醇、二硫蘇糖醇1 mmol/L、苯甲基磺酰氟0.5 mmol/L、1×蛋白酶抑制劑混合物）裂解30 min，13 000 r/min離心10 min，吸取上清，加入Anti-FLAG M2 Beads于4℃下孵育3 h，CF0.15洗滌4次后加入2×蛋白上樣緩沖液，進行Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 外源性及內(nèi)源性ubiquilin 4蛋白定位

轉(zhuǎn)染后，外源ubiquilin 4在細胞核和細胞質(zhì)均有分布（圖1A）。采用Anti-ubiquilin 4特異性抗體及Alexa Fluor 594熒光標(biāo)記羊抗小鼠二抗進行內(nèi)源性ubiquilin 4定位檢測，細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，紅色熒光信號檢測的內(nèi)源性ubiquilin 4主要定位于細胞核和細胞質(zhì)（圖1B），這與外源性ubiquilin 4的表達結(jié)果一致。

圖1 細胞內(nèi)ubiquilin 4蛋白定位

2.2 ubiquilin 4蛋白的原核表達

將原核表達質(zhì)粒pGEX和pGEX-UBQLN4分別轉(zhuǎn)化BL21菌株感受態(tài)細胞，通過不同的ⅠPTG濃度誘導(dǎo)其表達，并在不同的誘導(dǎo)時間點收集菌液。經(jīng)考馬斯亮藍染色，在ⅠPTG的濃度為0.1～0.6 mmol/L時均能夠得到與預(yù)計相對分子質(zhì)量大小相一致的條帶，并且相對表達量隨著時間的延長而增加，表明pGEX-UBQLN4在大腸桿菌中成功表達（圖2）。不同濃度ⅠPTG誘導(dǎo)表達收集的菌液裂解后，將菌液裂解后的上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色，表達的GST蛋白為可溶性蛋白，主要分布于上清中，而GST-ubiquilin 4在上清和沉淀內(nèi)均有分布，表明GST-ubiquilin 4既可存在于包涵體中，也可溶于菌液上清中。

圖2 可溶性ubiquilin 4蛋白原核表達條件優(yōu)化

2.3 ubiquilin 4相互作用蛋白質(zhì)譜鑒定

GST-pull down結(jié)果顯示，GST-ubiquilin 4與裂解液對照孵育組對比，可見一條差異條帶，并對其進行蛋白質(zhì)譜鑒定。根據(jù)所選條帶的相對分子量大小和蛋白質(zhì)譜鑒定的蛋白得分，本研究選擇相對分子量在＞170 kD，并且質(zhì)譜鑒定分數(shù)高于100分的蛋白作為候選蛋白進行統(tǒng)計，其中，MYH9肽段的數(shù)量所占百分比為63.96%，MYH10肽段的數(shù)量所占百分比為17.12%，MYH11肽段的數(shù)量所占百分比為11.71%，MYH14肽段的數(shù)量所占百分比為7.21%。（圖3，表1）

圖3 ubiquilin 4相互作用蛋白鑒定

表1 蛋白質(zhì)譜鑒定出的ubiquilin 4相互作用蛋白

2.4 免疫共沉淀驗證ubiquilin 4相互作用蛋白

將MYC-MYH9與FLAG-UBQLN4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK298T后提取細胞總蛋白，用FLAG-ubiquilin 4進行免疫共沉淀后進行Western blot法檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空白載體pLVX、單獨轉(zhuǎn)染MYC-MYH9和FLAG-UBQLN4的泳道均未能夠檢測到MYCMYH9條帶，而同時轉(zhuǎn)染MYC-MYH9和FLAGUBQLN4對FLAG-ubiquilin 4進行免疫共沉淀則可以檢測到MYC-MYH9蛋白條帶（圖4）。

圖4 免疫共沉淀法驗證ubiquilin 4與MYH 9的相互作用

3 討論

已有研究表明，泛素-蛋白酶體降解途徑在腫瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用。某些與泛素結(jié)合的癌基因蛋白（如N-myc、c-myc等）在蛋白酶體降解時受到阻礙，不能及時地從細胞內(nèi)清除，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生癌變。此外，一些抑癌基因的不穩(wěn)定也已證實與泛素化降解有關(guān)，例如，抑癌基因蛋白p53在某些腫瘤中經(jīng)泛素化降解后作用增強，導(dǎo)致細胞基因異常擴增，從而引發(fā)腫瘤[16-17]。UBQLN4屬于泛素類蛋白家族，目前已有研究報道ubiquilin 4在蛋白的泛素化降解方面具有重要的作用[12,14-15]。

本研究將ubiquilin 4在原核細胞中進行表達，采用標(biāo)簽純化方式篩選出與ubiquilin 4發(fā)生相互作用的蛋白，并在MKN45細胞中通過免疫共沉淀法和蛋白質(zhì)質(zhì)譜方法進行鑒定，結(jié)果顯示，MYH9是與ubiquilin 4發(fā)生相互作用的蛋白。

MYH9是細胞骨架的組成部分，屬于Ⅱ型肌球蛋白。其激活后可在細胞內(nèi)裝配成肌球蛋白絲，通過頭部的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶水解ATP產(chǎn)生能量，促進肌絲移動引發(fā)收縮力，從而介導(dǎo)細胞的分裂、遷移等過程[18]。近年來，關(guān)于MYH9在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用越來越受到關(guān)注。遷移與侵襲是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因，并且腫瘤上皮細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）也是腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要機制，這些均與MYH9影響細胞的黏附延展、趨化及運動等功能有關(guān)[18-19]。劉軍等[20]通過免疫組織化學(xué)染色法及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)，MYH9在骨肉瘤組織中的表達水平高于骨肉瘤癌旁組織（59.6%vs26.9%，P＜0.05），并且使用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）干擾技術(shù)將骨肉瘤細胞中MYH9的表達沉默，通過Western blot法檢測EMT相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，上皮細胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達增加，間質(zhì)細胞標(biāo)志物Vimentin蛋白的表達減少，提示MYH9沉默抑制了骨肉瘤細胞的EMT，表明MYH9在骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。Derycke等[21]研究也顯示MYH9可以通過抑制E-cadherin和Catenin復(fù)合體的形成，誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生EMT，因此，MYH9在乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。鄭夢穎等[22]收集60例肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織，檢測MYH9的表達情況，結(jié)果顯示MYH9在肝癌組織中的表達水平高于癌旁組織（63.33%vs41.67%，P＜0.05）；Western blot法檢測顯示MYH9蛋白在人肝癌細胞株SMMC-7721及HepG2中的相對表達量均高于正常人肝細胞株LO2（P＜0.05）；同時還發(fā)現(xiàn)MYH9與肝癌患者的腫瘤直徑、Edmondson分級、TMN分期及是否門靜脈侵犯等均有關(guān)，這表明MYH9在肝癌的進展中發(fā)揮了一定的作用。此外，MYH9在胃癌、肺癌、腎癌及結(jié)腸癌等多種腫瘤中的作用均有相關(guān)報道[23-28]。這些研究均表明MYH9在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，雖然ubiquilin 4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，但其參與腫瘤細胞內(nèi)生物學(xué)功能的具體機制尚不清楚，本研究通過標(biāo)簽純化及蛋白質(zhì)譜鑒定等方式篩選出與ubiquilin 4相互作用的蛋白，為闡明ubiquilin 4在腫瘤中的發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。

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